细胞凋亡与疾病

第九章细胞凋亡与疾病第一节概述第二节细胞凋亡的影响因素及发生机制第三节细胞凋亡过程与调控第四节细胞凋亡的常用检测方法简介第五节细胞凋亡调控异常与疾病男婴，头位剖宫产出生2天,体重3kg.产前诊断:胎儿宫内窘迫,脐带绕颈,羊水过少.产后诊断缺血缺氧性脑病,羊水污染Ⅰ度。生后牛奶喂养,第2天白天哭吵,哭声大,面色红,心肺听诊无异常.晚上9:00入睡,凌晨3:00发现患儿死亡.家属要求解剖查明死因.结果:显微镜下可见大脑轻度水肿。原位末端标记法检测发现大脑海马回细胞凋亡阳性率为55%,主要分布在低氧敏感区；大脑脑干细胞凋亡阳性率为96%，主要分布在与面部感觉、头部位置相关的背侧核区。结论：宫内窘迫、脐带绕颈导致反复缺氧、羊水污染等导致大量细胞凋亡，大脑关键区域（如脑干）功能丧失致死。思考：1.该患儿猝死的原因和机制是什么?2.为什么其大脑细胞会发生凋亡?Clinicalexample细胞凋亡名称的由来英国Aberdeen大学病理系Kerr教授1972年我和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的细胞死亡方式，联想到秋日落叶，我们就把它称作Apoptosis细胞凋亡的概念凋亡(apoptosis)：由内外源因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston细胞凋亡的意义●生理意义○清除多余的、失去功能价值的细胞确保器官、组织的正常生长、发育○清除受损、衰老和突变的细胞○维持内环境的稳定○清除受染细胞，发挥防御作用●病理意义○该死的细胞不死（凋亡不足）○不该死的细胞死亡（凋亡过度）调控细胞凋亡过程是防病治病的新途径确保正常生长发育例如：人胚胎肢芽发育过程中的指（趾）间组织通过细胞凋亡机制而被逐渐消除，形成指（趾）间隙。CTL细胞杀死肿瘤细胞细胞凋亡与坏死的区别凋亡坏死●诱导因素生理性、病理性病理性损伤(低氧，毒素等)●基因调控有，主动过程无，被动过程●病变范围发生于单个细胞一般发生于多数细胞●细胞形态细胞皱缩，核固缩，细胞肿胀，胞膜及细胞器相对完整胞膜及细胞结构破坏●凋亡小体有无●炎症反应缺乏存在●生化特点有新蛋白质合成，耗能无新蛋白质合成，不耗能●DNA分解DNA片段化(180-200bp)，弥漫性降解，电泳呈“梯”状条带电泳呈均一DNA片段■凋亡细胞（实体细胞）与周围细胞脱接触■胞膜空泡化（Blebbing）■细胞固缩（Condensation）、核固缩和发芽■凋亡小体（Apoptoticbody）凋亡细胞(扫描电镜)凋亡细胞(透射电镜)APLApoptosis1.形态学改变►凋亡时细胞的主要变化细胞凋亡异常出芽染色质边聚凋亡小体形成磷脂酰丝氨酸外翻细胞凋亡与坏死的形态变化■内源性核酸内切酶激活Ca2+/Mg2+增加核酸内切酶活性Zn2+抑制核酸内切酶活性■DNA片段化（DNAladdingpattern）激活核酸内切酶核小体连接区发生DNA降解，寡核小体片段（160～200bp的倍数）■钙超载（Calciumoverload）Ca2+载体A23187B淋巴细胞内[Ca2+]↑诱导B细胞凋亡（Ca2+在细胞凋亡中充当凋亡信号传递的角色）2.生化改变（Thebiochemicalcharacteristicsofapoptosis）细胞凋亡异常■细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻（caspase激活、PKC活化、蛋白合成等）第二节细胞凋亡的影响因素及发生机制一、常见诱导或抑制凋亡的因素1.生理性凋亡信号：激素和生长因子失衡—缺乏或过多2.病理性凋亡信号：氧化应激的作用死亡受体的激活线粒体结构和功能的改变生物性理化性免疫性诱导性因素（Inducers）抑制性因素（Inhibitors）理化因素射线、高温、强酸、细胞因子IL-2、NGF等强碱、应激、抗癌药激素ACTH、睾丸酮、雌激素激素和因子糖皮质激素、TNF其它Zn2+、苯巴比妥、半胱氨免疫性因素CTL分泌的端粒酶酸蛋白酶抑制剂、EBV、病原体因素HIV、HCV牛痘、病毒、中性氨基酸二、细胞凋亡的发生机制(一)氧化损伤----形成氧化应激状态1、氧化损伤诱导细胞凋亡的依据：①各种氧化剂（如H2O2）可直接诱导细胞凋亡；②抑制超氧化物歧化酶（supexoxidedismutase,SOD）活性可诱导细胞凋亡；③抗氧化剂（VitE、胡萝卜素等）可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素（TNF、电离辐射）引起的细胞凋亡。2、氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制：①引起DNA损伤，激活P53基因；②引起DNA损伤，活化多聚ADP核糖合成酶，耗竭NAD，消耗大量ATP；③攻击细胞膜不饱和脂肪酸，脂质过氧化；④激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶；⑤细胞膜损伤，Ca2+内流增多；⑥损伤线粒体，使其膜通透性增加，膜电位发生改变；⑦活化核转录因子NF-кB、AP-1，加速凋亡相关基因表达。（二）钙稳态失衡1、细胞钙稳态失衡诱导细胞凋亡的依据：①各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程；②凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升，并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用（核酸内切酶、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活，细胞膜的空泡化）；③钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病（如神经退行性疾病）。2、钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能机制：①激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链；②激活谷氨酰胺转移酶，催化肽链间的酰基转移酶，肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；③激活核转录因子，加速凋亡相关基因表达；④Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露核小体之间的连接区内的酶切位点，有利于核酸内切酶切割DNA。（三）线粒体损伤细胞凋亡期间线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜跨膜电位（△ψm）下降，能量代谢水平显著降低。1、依据为：①抑制线粒体三羧酸循环或呼吸链功能可诱导细胞凋亡；②胞核出现凋亡改变之前，常先有线粒体△ψm下降；③阻止线粒体通透性的改变，可防止细胞凋亡。2、可能机制：线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（PTP）具有调节线粒体膜通透性的作用。正常情况下，绝大多数PTP处于关闭状态。当线粒体跨膜电位在各种凋亡诱导因素作用下降低时，PTP开放，导致线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡启动因子细胞色素C凋亡蛋白激活因子（Apaf-1）凋亡诱导因子（apoptosis-inducing,AIF）等从线粒体内释放出来。细胞色素C与Apaf-1相互作用可激活caspase-9；而AIF可快速激活核酸内切酶，并增强caspase-3的水解活性。一、细胞凋亡的过程1信号转导2基因激活3凋亡执行4凋亡清除破坏生命全部指令胞结构全部解体凋亡诱导因素受体死亡信号凋亡相关基因激活凋亡细胞被吞噬cAMPCa2＋神经酰胺DNase激活Caspases激活+第三节细胞凋亡过程与调控二、细胞凋亡的信号转导途径（一）参与细胞凋亡的第二信使系统1.胞内Ca2+信号系统:依据有：①细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升；②用Ca2+载体A23187，升高BCCa2+水平，BC凋亡；③用Ca2+络合剂降低细胞内Ca2+水平，可阻止凋亡。2.cAMP/PKA信号系统：依据有：①双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡；②糖皮质激素使cAMP上升。3.神经酰胺信号系统：神经酰胺（ceramide,CM）是神经鞘磷脂在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类转导细胞外应激信号的第二信使物质。4.二酰甘油/蛋白激酶C信号系统：二酰甘油是磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催化下产生的一种第二信使物质。二酰甘油是PKC内源性激活物。（二）细胞凋亡的信号通路（1）死亡信号通路：死亡配体（如TNF-a、FasL/CD95L、TWEAK和TRAIL）与膜上相应的死亡受体(TNFR、Fas／CD95、DR3、DR4／DRS)结合传递信号，胞内caspase-2、-8、-10被募集并激活。活化的caspase-8释放到胞质中启动caspase的级联反应，激活下游的效应caspases，如caspase-3，-6和-7，导致细胞凋亡。（2）交叉通路：激活的caspase-8同时能使胞质中bcl-2家族的促凋亡因子Bid（bandinginterfacedatabase）断裂成一种截短的Bid（truncatedBid,tBid），tBid转移到线粒体上，诱导细胞色素C从线粒体释放进人胞质，从而把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号。（3）线粒体通路：Fas细胞表面受体（跨膜蛋白）；存在于多种组织细胞内；天然表达或转染表达的Fas基因有促凋亡作用；Fas抗体模拟天然配基与受体Fas抗原结合激活凋亡信号转导致细胞凋亡FasL病毒感染的靶细胞细胞凋亡异常c-FLIP:cellularFas-associateddeathdomain-likeIL-1beta-convertingenzymeinhibitoryprotein三、细胞凋亡的调控因子（一）Caspases酶系√属于半胱氨酸蛋白酶家族，Caspase1-14个成员。根据其生物学功能，可划分为ICE和Ced-3两个亚家族，ICE亚家族：caspase-1，4，5，主要辅助炎症反应；ced-3亚家族：caspase-2，3，6，7，8，9，10，则主要参与凋亡过程。√caspases在凋亡中的作用可以分为，启动型（caspase-2，8，10，9）效应型（caspase-3，6，7）。√它们参与凋亡的机制主要是：①灭活凋亡抑制蛋白。②以结构蛋白为靶子，导致结构蛋白解体。③以效应蛋白为靶子，调节或解体效应结构域。④降解细胞基因组DNACasepase-8FasTRADDTNFR1细胞凋亡Casepase级联反应FADD活化的Casepase-8FADD死亡受体介导的凋亡通路(二)Bcl-2家族√Bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2）基因的缩写形式。√Bcl-2家族的成员是生存和死亡信号至关重要的整合因子。该家族可细分为三大类：抗凋亡成员，如Bcl-2和Bcl-XL促凋亡成员，如Bax和BakBH3-only死亡蛋白√Bcl-2是第一个被确认具有抑制细胞凋亡作用的基因。主要分布在线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜等处；Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡；√Bcl-2抗凋亡作用机制为：①直接的抗氧化作用；②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质；③抑制促凋亡性调节蛋白质Bax、Bak的细胞毒作用；④抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活；⑤维持细胞钙稳态。BaxBax超表达→线粒体膜形成多聚体→影响线粒体完整性；Bax形成同源二聚体→抑制Bcl-2→诱导凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体→促进细胞生长；胞内Bax与Bcl-2蛋白比例变动→调控凋亡的发生。（三）p53（被美誉为“分子警察”）√P53基因有野生型（wtp53）和突变型（mtp53）。√野生型P53基因编码的P53蛋白是一种DNA结合蛋白，P53蛋白在细胞周期G1期发挥检查点的功能：（1）检查染色体DNA的损伤，一旦发现有缺陷DNA，它通过剌激CDI的表达，阻止细胞进入下一周期，启动DNA修复机制；（2）如修复失败，P53则启动细胞凋亡机制，诱导细胞凋亡。√P53突变型则具有癌基因的作用，可以诱导细胞发生恶性转化。（四）IAPs√凋亡抑制蛋白家族（InhibitorofApoptosisprotein，IAP）是近年发现的一类抑制细胞凋亡的蛋白因子√目前已经得以证实的IAP有两种，一种是Cp-IAP，另一种是Op-IAP。√人类的IAP可以与caspases直接作用抑制其功能，泛素化水解procaspase或活化形式的caspase，通过结合JNK1调节因子TAK1激活JNK1和NF-κB，发挥非caspase依赖的凋亡抑制作用。