特定蛋白的检测方法与质量控制

特定蛋白的检测方法与质量控制重庆市涪陵中心医院涂伟2020/11/10几个有关蛋白数字：200050020050概述特定蛋白：白蛋白、前白蛋白、转铁蛋白、C反应蛋白、AAT、AAG、铜蓝蛋白、视黄醇结合蛋白、纤维蛋白、巨球蛋白、免疫球蛋白、补体、脂蛋白………因为这些蛋白都具有”某一特定抗原性”,多采用免疫方法对血液、尿液、脑脊液等标本进行检测,故专称这些蛋白统称为”特定蛋白”。分类免疫球蛋白及补体系列风湿及类风湿系列尿微量蛋白系列急性炎症蛋白营养状态神经系统疾病检测血液病疾病检测心脑血管疾病…………肾功能监测•尿微量白蛋白(MA)•尿转铁蛋白(TRU)•尿免疫球蛋白(IgU)•α1-微球蛋白(α1-M)•β2-微球蛋白(β2-M)•痕迹蛋白(CystatinC)心血管疾病风险评估•载脂蛋白A-1(apoA-1)•载脂蛋白B(apoB)•脂蛋白(a)(Lp(a))•超敏CRP神经系统疾病•白蛋白(ALB)•α2-巨球蛋白(AMG)•免疫球蛋白A(IgA,脑脊液)•免疫球蛋白G(IgG,脑脊液)•免疫球蛋白M(IgM,脑脊液)免疫功能监测•免疫球蛋白A(IGA)•免疫球蛋白E(IGE)•免疫球蛋白G(IGG)•免疫球蛋白M(IGM)•IgG1~4亚型•补体C3(C3)•补体C4(C4)•轻链(KAP)•轻链(LAM)•Free轻链•Free轻链类风湿类关节炎•类风湿因子(RF)•抗链球菌溶血素O(ASO)•C-反应蛋白(CRP)检测项目人体示意图不同检测方法检测范围化学发光免疫检测临床生化检测治疗药物甲状腺激素性激素抗原心肌标志物传染病维生素血清蛋白免疫比浊法常量检测微量检测痕量检测检测方法•胶乳法•免疫比浊法检测方法发展历程出现年代技术名称特点•1897年•经典免疫沉淀技术•灵敏度低•繁琐费时•自动化程度低•1959年•放射免疫分析技术•灵敏度高•成本较低•不易自动化•有放射性污染•1970年•酶免疫分析技术•特异性强•影响因素多•不易自动化•无放射性污染•1970年•发光免疫分析技术•灵敏度最高•线形范围广•过程复杂,耗时长•成本较高•易于自动化•无放射性污染•1959年•1967年•1977年•免疫比浊法1终点透射法2终点散射法3速率散射法**•灵敏度高•稳定快速•线形范围宽•成本较低•易于自动化•无放射形污染定性定量专业化半定量透射免疫比浊法原理抗原与抗体在一定缓冲液中形成IC，当光线透过反应溶液时，由于溶液内IC粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。透射比浊法测定遵循的原理•Lambert-Beer定律（朗伯-比尔定律）检测器光源透镜滤光片平光线透射光透射免疫比浊法•IC足够大(35-100nm)•IC足够多•控制温度和时间•使用增敏剂•保证抗体效价•标准曲线定量反应要求透射免疫比浊法•灵敏度较低。要求抗原－抗体复合物分子应足够大、足够多，分子太小则入射光直接通过。•直线光路，灵敏度有缺陷。•透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原－抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原－抗体温育反应时间，检测时间较长。缺陷散射免疫比浊法抗原抗体复合物对一定波长的光产生折射、偏转，偏转角度及散射光强度与复合物粒子的大小和量有关。原理单色器•Rayleigh定律（瑞利散射定律）粒子尺度远小于入射光波长时（小于波长的十分之一），其各方向上的散射光强度是不一样的，该强度与入射光的波长四次方成反比，这种现象称为瑞利散射。散射比浊法测定遵循的原理散射免疫比浊法•终点散射比浊分析•速率散射比浊分析终点(定时)散射法速率散射法测试时间•抗原抗体反应达到平衡•抗原抗体反应开始到反应速率最大测试内容•测定复合物总量变化•测定复合物形成速率测定过程•在反应开始后测定两次(7.5秒和6分钟或倍数)散射信号，将差值作为计算抗原标准•在反应开始后90秒内,每5秒钟进行200次读数,通过18个循环共3600次读数，检测到反应的最大速率峰，从而计算抗原浓度终点(定时)法检测:反应达到平衡--反应体系浊度不再变化12速率法检测:反应最大速率-反应速率蜂出现136002时间散射信号散射比浊信号曲线1加样本2加试剂•速度慢(几分钟)•关注两点,易受干扰,结果重复性差•两次读数,对仪器硬件要求一般•速度快(几十秒)•关注过程,动态分析抗干扰,结果重复性好•3600次读数,对仪器硬件要求较高应用特点抗原抗体结合速率抗原抗体结合量终点散射法与速率散射法透射比浊法散射比浊法测定内容•透射光强度•散射光强度测定原理•Lambert-Beer定律•Rayleigh定律应用特点常用于生化系统,主要由于精度不够:•复合物的分子应够大，太小则阻挡不了光线的通过•复合物的数量应够多，太少则对溶液浊度变化影响太小常用于特定蛋白的测定•灵敏度高•重复性好•测定范围宽透射比浊法与散射比浊法特定蛋白检测的实验室影响因素及质量控制•基本等同常规的实验检测项目分析前质量控制类似•了解实验室可以开展的检验项目•熟悉检验项目的方法学特性，如不准确度等•通知病人进行适当的准备•避免药物干扰因素•适当的采集时间•适当的采集量•及时送检•对不合格标本及时进行处理，尤其是脂血标本的影响•适当的采集顺序•对抗凝标本进行及时和适当的摇匀•及时离心•避免剧烈震荡造成溶血分析前的质量控制分析中的质量控制检验结果的溯源性：仪器生产厂家沿用国际认可的标准品CRM-470IFCCCAP1989年AbbottBeckmanBehring厂商欧洲共同体参考局（BCR）认可1992年各重要厂商将其作为第一标准，提高不同参加的可比性，避免标值化不一带来的差异。钩状效应（HOOK现象）会导致假阴性抗原过量检测技术保证特定蛋白分析系统的稳定性—仪器、试剂、校准品、质控品分析后的质量控制临床反馈意见收集，相互沟通，持续改进临床应用的评估，与相关疾病的相关性检测结果的影响因素