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食品中大肠菌群测定（一）参考GB4789．3-20101、了解大肠菌群的定义及食品中大肠菌群测定在食品卫生检验中的意义。2、练习并掌握大肠菌群的检验方法。一、目的二、原理1、大肠菌群大肠菌群系指一群在37℃、24小时能发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要由肠杆菌科中埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属的一部分及沙门氏属的Ⅲ亚属细菌组成。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每1g（或mL）检样内大肠菌群近似可能数MPN（themostprobablenumber-简称MPN）表示2、测定的意义3、大肠杆菌的生物学特性基本形态此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。在普通营养琼脂上有3中菌落形态：1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝；3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。培养特性：大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46℃。三、材料1、食品样品乳制品除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、恒温水浴箱、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。3、仪器设备月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA)、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液、1mol/L氢氧化钠（NaOH)、1mol/L盐酸（HCI)。4、培养基和试剂第一法大肠菌群MPN计数法。第二法大肠菌群平板计数法。四、检验方法10倍系列稀释选择合适稀释度接种LST肉汤管36℃±1℃.48h±2h产气不产气25g检样-225mL稀释液大肠菌群阴性BGLB肉汤(36±1)℃48h±2h不产气大肠菌群阳性大肠菌群阴性产气报告大肠菌群MPN检验流程查MPN表1、样品的稀释（1）固体和半固体样品称取25g样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。第一法大肠菌群MPN计数法（2）液体样品以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。（3）样品匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤）,36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。2、初发酵试验记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。3、复发酵试验根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录B)，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。4、大肠菌群最可能数（MPN）的报告大肠杆菌0157显色培养基上的菌落在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征典型菌落为红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为2-3mm或更大。大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上典型特征典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征试验流程1、样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。（1）选取2个～3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种两个无菌平皿，每皿1mL。同时分别取1mL生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。（2）及时将15mL-20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±l℃培养18h-24h。2、平板计数（3）平板菌落数的选择选取菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。2、平板计数（4）、证实试验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h-48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。2、平板计数（5）大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。2、平板计数例：10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。国标4789.3的08版与03版主要不同1、名称更改以大肠菌群计数代替原来的大肠菌群测定。2、增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法。3、大肠菌群的MPN法以乳糖为主改为以月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为主的要培养基的MPN法。4、大肠菌群的MPN法中原“报告每100ml（或g）大肠菌群的MPN值”改为“报告每1ml（或1g）大肠菌群的MPN值”。比较区别GB/T4789.38--2008大肠杆菌的计数03版流程一、步骤取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同，做成1:10的均匀稀释液为检样。同一稀释度在做菌落总数测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。1、乳糖发酵试验根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置36±1℃温箱培养24±2小时，如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。2、分离培养将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。可疑菌落特点：具有金属光泽的深紫黑色菌落；不带或略带金属光泽的菌落；中心色较深的淡紫黑色菌落。3、证实试验在上述平板上挑取可疑大肠菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱培养24±2小时,观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。4、报告根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。二、结果根据证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)大肠菌群的最可能数。三、注意事项1、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，初发酵阳性管，经过后两步，有可能成为阴性。只做一步，会有相当多的合格样品作为不合格处理，应注意。2、胆盐可抑制革兰氏阳性菌的生长，有利于大肠杆菌的生长繁殖。3、接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。4、大肠菌群菌落在EMB琼脂上大多呈紫黑色有金属光泽或无金属光泽。应取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，且革兰氏染色为阴性，可做出判定。5、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。6、MPN检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是最低3管为阳性，最高3管为阴性。如无法估测样品中的菌数时，应做一定范围的稀释度。7、MPN检索表只提供了3个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。酱油（GB/T2717-2003）细菌菌落总数：≤30000cfu/ml大肠菌群：≤30MPN/100ml肠道致病菌：不得检出全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999）特级一级二级细菌菌落总数：≤20000≤30000≤50000（cfu/ml）大肠菌群≤40≤90≤90（MPN/100g）肠道致病菌：不得检出不得检出不得检出巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：≤30000cfu/ml大肠菌群：≤90MPN/100ml肠道致病菌：不得检出生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数cfu/ml：≤100总大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出耐热大肠菌群cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出大肠埃希氏菌cfu/100ml或MPN/100ml：不得检出瓶(桶)装饮用纯净水卫生标准》(GB17324-2003)细菌菌落总数cfu/ml：≤20大肠菌群MPN/100ml：≤3致病菌(肠道致病菌和致病性球菌)：不得检出霉菌和酵母菌cfu/ml:不得检出