离子交换和亲和层析

5、离子交换层析优点：①具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大；有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活；多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。（1）基本原理离子交换剂是由基质电荷基团（或功能基团）反离子纤维素—O—CH2—COO−—Na+反离子基质电荷基团图5．羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图每个分子能够和离子交换剂形成的静电键的数目离子交换剂与生物大分子间的亲和力取决于:由于不同蛋白质有不同的pI，在同一pH下，各种蛋白质所带的电荷种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用的强弱不同，有些甚至完全不吸附。从而将有不同电荷的蛋白质分开。然后通过改变缓冲液的盐浓度（离子强度）和pH，用溶液中的离子置换吸附上的蛋白质，吸附力弱的先洗脱下来，吸附力强的后洗脱下来，从而使蛋白质混合物的组分分开。电荷数目多寡与分子中电荷的排布有关。1）吸附阶段：①紧密吸附：静电键的数目相当多，以致它们同时解离的概率为零。处于此状态的物质，被吸附于柱顶而不下移。②有限吸附平衡：静电键的数目较少，它们同时解离的概率达到一个有限值（01间）。只有在此范围内才能达到较高的分辨率。③解吸状态：静电键数目极少，同时解离的概率为1，完全不吸附。2）洗脱（解吸附）阶段：洗脱方法增加缓冲液的离子强度改变pH，洗脱方式梯度洗脱：阶段洗脱：（2）离子交换剂的分类和性质离子交换剂应满足下列要求：①有高度的不溶性②有疏松的多孔结构或巨大的表面积③有较多的交换基团④有稳定的物理化学性质离子交换剂的分型1）阳离子交换剂磺酸基团（-OSO3H）甲基磺酸基团（-O-CH2-SO3H）乙基磺酸基团（-O-CH2-CH2-SO3H）强阳离子交换剂磷酸基团（-OPO3H2）亚磷酸基团（-OPO2H）中强阳离子交换剂酚羟基（-）羧酸（-COOH）弱阳离子交换剂弱酸性：R−COO–H++Na+R−COO–Na++H+强酸性：R−S03−.H++Na+R−S03−.Na++H+弱碱性：R−NH3+(OH)–+Cl某些交换反应如下：强碱性：R−N+(CH3)3OH–+ClRN+(CH3)2Cl–OHRNH3+Cl–OH2）阴离子交换剂季胺盐[−N+(CH3)3]三乙基氨基乙基[-O-（CH2)2−N+(C2H5)3]强阴离子交换剂叔胺[−N+H（CH3）2］仲胺盐(−N+H2CH3)伯胺盐（−N+H3）二乙基氨基乙基[-O-(CH2)2-N+H(C2H5)2]氨基乙基[-O-(CH2)2N+H3]弱阴离子交换剂离子交换剂根据化学性质分为三类：由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，再引入所需的酸性基团或碱性基团。例如聚苯乙烯磺化型离子交换树脂是由苯乙烯与二乙烯苯共聚和再磺化引入磺酸基合成。磺酸根连在树脂上，氢离子与磺酸根的负电荷互相平衡，可与外来离子相互交换。树脂离子交换剂：不适用于大分子的蛋白质分离纯化多用于小肽和氨基酸的分离纯化及无离子水的制备。特点：交联孔径小，吸附力太牢，要求洗脱条件剧烈阳离子交换剂有:羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有:二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）纤维素离子交换剂：是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。特点：对蛋白质的交换容量大，结合力弱，洗脱条件缓和，因而是分离纯化生物活性大分子的理想的工具。非特异性吸附少，不易使蛋白质变性，能引入大量活性基团而不破坏骨架故交换容量很高是将交换基团连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。交联葡聚糖离子交换剂：特点：阳离子交换剂有:SE-Sephadex(强)CM-Sephadex(弱)阴离子交换剂有：QAE-Sephadex(强)DEAE-Sephadex（弱）表7-6一些常用的纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂离子交换剂可电离基团I、阳离子交换剂CM-纤维素（弱酸型）羧甲基P-纤维素（中强酸型）磷酸基SE-纤维素（强酸型）磺乙基SP-Sephadex(强酸型)磺丙基II、阴离子交换剂AE-纤维素（弱碱型）氨基乙基PAB-纤维素（弱碱型）对氨基苯甲基DEAE-纤维素（中强碱型）二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex（中强碱型）二乙基氨基乙基TEAE-纤维素（强碱型）三乙基氨基乙基QAE-Sephadex（强碱型）二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基指单位重量交换剂中可解离基团的数量，是离子交换剂的特性常用单位重量或单位容积交换剂的能交换的毫克当量离子来表示；交换容量影响交换容量的因子：筛孔离子强度pH（3）离子交换层析条件的选择1）离子交换剂的选择交换容量是提供交换离子的量度，是选用交换剂数量的重要参考依据。选用何种交换剂还要根据被分离的物质所带电荷、分子大小，及是否耐酸碱等对离子交换剂进行选择。①阴、阳离子交换剂的选择当pHpI时,应选择阳离子交换剂；当pHpI时,应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂。例如，一蛋白质的pI为5．若该物质在pH5～8稳定时，则应选择阴离子交换剂；若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。对于已知等电点的物质在中性或偏碱性的条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附；向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被阴离子交换剂吸附。对于未知等电点的物质可参照电泳的结果①阴、阳离子交换剂的选择②强、弱离子交换剂的选择强性离子交换剂:应用范围广，但选择性低，所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。比如简单的、复杂的、无机的及有机的阳离子都可与强酸性阳离子交换。弱性离子交换剂选择性较高，适用的pH范围较窄，这种离子交换剂在pH为中性的溶液中交换容量也高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品习惯采用弱性离子交换剂为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和0H型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。③不同离子型交换剂的选择离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。如阳离子交换剂的反离子可以是H+(称H型）Na+（称Na型）NH4+等树脂基质是疏水性化合物而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。④不同基质离子交换剂的选择在分离生命大分子物质时，一般认为后三种基质(亲水性化合物)比前一种基质(疏水性化合物)更为优越。由于后三种是亲水性的，且对生命大分子物质的吸附和洗脱都比前者温和，所以采用后者基质制成的离子交换剂，被分离物质活性不易受到破坏。如选用阴离子交换剂,pH值一般比有效成分的pI值高一个单位;选用阳离子交换剂,pH值一般比有效成分的pI值低一个单位;离子强度为0.1时，就能很快把有效成分与杂质分开。2）缓冲液的选择选用的起始缓冲液其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合.其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值是随着离子交换剂性质变化而变化。选用的洗脱液缓冲液选择的关键在于:了解有效成分的等电点。A、取10支1.5ml试管，在各管中加入0.1gSephadex或1.5mlSepharose（或Sephacel）离子交换剂B、用不同pH值0.5mol／L缓冲液分别洗涤10次（阴离子交换剂选pH5～9，阳离子选pH4～8，配方见表5-8)C、用不同pH值0.05mol／L（对Sephadex)或0.01mol／L（对Sepharose或Sephacel）缓冲液（各管PH值仍与洗涤液相同）平衡5次（每次洗涤、平衡的上清液均可用倾斜法或离心法除去，但最后一次应采用离心法除去，试管间操作要尽量一致）初步选择缓冲液（pH值）的简便方法：D、同样量的待分离样品加到管中，缓慢混合5～10min，静止沉淀E、测定各管有效成分的含量、绘制出相应图谱（见图5-9A）。最适pH(7.0)的选择在pH7.0以上的缓冲液中，有效成分全部被吸附了。因此，起始缓冲液（即样品的溶解液和层析柱的平衡液）pH可选用7.0。在各管中加入不同离子强度的缓冲液，经过洗涤、平衡、加样、测定含量，即可绘制出相应的图谱（见图5-9B）。当离子强度()0.15时，样品中的有效成分基本上全被离子交换剂吸附了；但当提高到0.3或0.3以上时，有效成分却全部留存在溶液中。因此，起始缓冲液的应确定为≤0．15，而限制性缓冲液的应确定为≥0.3。束缚(0.15mol/L)和洗脱(0.3mol/L)时盐浓度的选择起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定在10支盛离子交换剂的试管中，先用相同缓冲液进行充分洗涤、平衡，然后按总交换容量的百分数，分别加入不同量的样品液，吸附毕，取上清液测定待分离物的含量，并绘制相应图谱（见图59C）。从图看出，离子交换剂的总交换容量达40％时，其吸附力已呈饱和状态。这表明该交换剂中加入样品液的最大量为总交换容量的40％。3）加样量的确定在pH7.00.1mol/L盐浓度时,最佳操作容量(总交换量的40%)的选择五、亲和层析可对天然生物活性物质进行高特异性的分离和纯化。（一）基本原理抗原和抗体激素和受体酶和底物及辅酶酶和抑制剂酶和调节效应物RNA和其互补的DNA等生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力。利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法优点:亲和层析的过程配基固相化：将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和柱）。亲和吸附：将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。解吸附:用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。亲和层析中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。（二）固定相亲和层析固定相是由三部分构成基体（Matrix）间隔臂（Spacer-Arm）配位体（Ligand）理想的基质应满足下面的要求：1、极低的非特异吸附性。2、高度的亲水性。3、较好的理化稳定性。4、大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合；5、适当的多孔性（即孔径大小和筛孔多少）。1、基体的选择聚丙烯酰胺凝胶葡聚糖凝胶多孔玻璃珠琼脂糖凝胶(1)具有稳定的物理化学性质(2)均匀、多孔的网状结构，允许大分子物质自由通透(3)流动性好(4)非特异性吸附少常用的基质优点最常用的活化方法是:用溴化氰活化琼脂糖，配体-NH2如：CH-Sepharose4B带有一个六碳长的臂有活性的末端羧基；环氧活化的Sepharose6B的臂上带有一个活化的酯基；AH-Sepharose4B的臂末端带有一个氨基CD1-Agarose含有N-氨基甲酸烷基酯首先把适当长度的氨基化合物共价结合到用溴化氰活化的琼脂糖上。制成稳定的衍生物构成“手臂”最多的方法是将琼脂衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物反应后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，这对增加配体与分离物之间的操作容量、提高分离效果是有益的。常用的氨基化合物1,6-己二胺6-氨基己酸在水溶性的碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含羧基或氨基的任何化合物结合成固相载体。例如用对氨基苯--D-硫代吡喃半乳糖苷作为配体纯化-半乳糖苷酶时，如果把配体直接连于sepharose4B上所产生的衍生物A，则不能吸附半乳糖苷酶。而当sepharose上引入氨乙基乙酰胺或引入3,3’-二氨基二丙胺琥珀酰胺再接配体时，所产生的衍生物B和C都能吸附-半乳糖苷酶2、配体的选择抑制剂效应物酶的辅助因子类似底物抗体[包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白质复合物抗体]其他物（如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金属离子）等。可选择的配体有例如，用抗生物素蛋白（也称亲和素）作为配体纯化含