第二讲-荧光探针

荧光探针1荧光基础知识荧光探针机制荧光探针的应用主要内容什么是荧光？紫外线紫外线荧光素溶液罗丹明溶液荧光分子hvhv＇（一）荧光（fluorescence）Luminescenceistheemissionoflightfromanysubstanceandoccursfromelectronicallyexcitedstates.Luminescenceisformallydividedintotwocategories,fluorescenceandphosphorescence,dependingonthenatureoftheexcitedstates.Theelectronintheexcitedorbitalispaired(ofoppositespin)tosecondelectronintheground-stateorbital.Consequently,returntothegroundstateisspin-allowedandoccursrapidlybyemissionofaphoton.Atypicalfluorescencelifetimeisnear10ns(110-9s).——PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,JosephR.Lakowicz发光：物质在热辐射之外以光的形式发射出多余的能量，而这种多余能量的发射过程具有一定的持续时间。两个主要特征：一、任何物体在一定温度下都有热辐射，发光是物体吸收外来能量后所发出的总辐射中超出热辐射的部分；二、当外界激发源对物体的作用停止后，发光现象还会持续一定的时间，成为余辉。荧光荧光和磷光：荧光（Fluorescence）：激发和发射两个过程之间的间隙极短，约为10-8秒。只要光源一离开，荧光就会消失。磷光（Phosphorescence）：在激发源离开后，发光还会持续较长的时间。磷光是一种缓慢发光的光致冷发光现象。所谓的在黑暗中发光的材料通常都是磷光性材料，如夜明珠。（二）基态、激发态、单重态、三重态、激发单重态、激发三重态分子都含有不停地运动着的电子。根据量子学理论，运动着的电子处于一系列不连续的能量状态（即能级），可以从一个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收和释放。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态,groundstate）。在一定条件下，电子可以吸收能量（如光能、电能、热能、化学能、摩擦能等）跃迁到较高能级（即激发态,excitedstate），这个过程称为激发。处于激发态的电子是不稳定的，它总是要跃迁回基态，并将多余的能量释放出去。跃迁的方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射方式跃迁，能量大多转化为热能。而以辐射方式跃迁，能量则转化为相应的光，这个过程称为发射（发光）。电子所处状态的多重性用M表示（即所处状态的轨道角动量），M=2S+1。S为电子自旋量子数的代数和，其值为0或1。分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对的。如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的该分子体系即处于单重态（或称单线态，singletstate）。如果分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子即处于激发单重态（singletexcitedstate）。如电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的改变，这时分子具有两个自旋不配对的电子，即S=1，分子处于激发三重态（tripletexcitedstate），用符号T表示。符号S0，S1，S2分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态；T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。激发单重态（自旋配对）和自旋翻转单重态（自旋配对）三重态（自旋平行）hv电子跃迁电子的多重态hvFluorescence电子跃迁单重态（自旋配对）Phosphorescence11JablonskiDiagram雅布隆斯基分子能级图1111光谱吸收光谱：化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲线。反映的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。激发光谱：固定发射波长（一般为发射波段中感兴趣的峰位），扫描化合物的发射光强与入射光波长的关系曲线。反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。发射光谱：固定激发波长（一般为激发波段中感兴趣的峰位），扫描化合物的发射光强与发射光波长的关系曲线。光谱对同一个荧光化合物而言，在其激发光谱范围内，采用任一波长进行激发，得到的荧光光谱只会有一个发射带。荧光寿命（FluorescenceLifeTime）荧光寿命与荧光量子效率是荧光化合物最重要的特性参数。荧光寿命（即激发寿命）是指分子在激发态的平均停留时间。大多数荧光化合物的寿命在纳秒级。长寿命荧光探针——时间分辨荧光技术平均荧光寿命的计算公式：τ=1/（kf+ΣK）kf：荧光化合物的荧光发射速率常数；ΣK：各种非辐射去活化过程的速率常数的总和；荧光发射是一种随机过程，只有少数分子其发射是在t=τ时发生。衰变过程：有63%的分子在t=τ前衰变，而37%在tτ的时刻衰变。YF=kf/（kf+ΣK）荧光量子产率荧光量子产率是荧光物质发射光子的数目与吸收光子数目之比。荧光量子效率可以下式表示：若非辐射衰减速率比辐射衰减速率小得多，即ΣKkf，则YF可接近于1。YF的数值总是小于1。荧光量子产率的数值越大，化合物的荧光越强。不发荧光或发弱荧光的物质，其荧光量子效率为0或很小。绝对荧光量子产率的测量较为困难，通常，荧光量子产率是通过参比法测量获得。即通过比较相同激发条件下所测得的积分荧光强度和对该激发波长的入射光的吸光度而加以测量。则荧光量子产率可通过下式获得：Yu、Ys:待测物质和参比物质的荧光量子产率；Fu、Fs：待测物质和参比物质的积分荧光强度；Au、As：待测物质和参比物质对该激发波长的入射光的吸光度。QuantumYieldStandards荧光检测技术常见影响因素（一）荧光与分子结构的关系大π键体系平面刚性结构取代基的影响苯（205/278）紫外萘（286/321）紫外蒽（365/400）蓝并四苯（390/480）绿并五苯（580/640）红（二）溶剂许多荧光物质，特别是带有极性基团的芳香化合物，其荧光性质容易受到溶剂的影响。溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。一般溶剂效应：溶剂的折射率和介电常数对荧光物质荧光性质的影响。特殊溶剂效应：荧光物质和溶剂分子之间的特殊化学作用，如氢键。一般溶剂效应是普遍存在的，而特殊溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊溶剂效应所引起的荧光物质的荧光性质的变化往往比一般溶剂效应所引起的显著。（三）温度温度是溶液荧光的重要影响因素。一般而言，溶液中荧光物质的荧光量子产率和荧光强度随温度的降低而增强，随着温度的升高而减弱。在检测温度系数（温度每升高1°C，溶液荧光变化的百分数）大的样品或进行荧光参数的精确测量[如荧光各向异性（荧光偏振）的测定）时，应使用恒温装置。（四）酸度（pH）对于荧光性质而言，可将弱酸或弱碱的分子和离子视为不同的型体（species），分别具有各自的荧光光谱和荧光量子产率。因此，实验时应严格控制溶液的pH，才能达到最好的灵敏度（sensitivity）和准确度(accuracy)。如果荧光物质是弱酸或弱碱，溶液pH的改变将对其荧光性质产生显著影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光光谱，对溶液的pH是非常敏感的。发荧光的无机配合物或螯合物对pH同样很敏感。利用某些物质在溶液中荧光行为的改变，不但可以判别各种滴定的终点，而且对研究物质在不同pH时构象变化等信息也是很有用的。吸收光谱发射光谱荧光素的吸收与发射光谱（五）稀溶液分析中的干扰因素物质在稀溶液（1μg/ml）中的稳定性远不如浓溶液。因此，储备液常配成浓溶液，待使用时再进行稀释。稀溶液分析需考虑的问题有：1、表面吸附：实验室常用的器皿如瓶子、吸管、移液管、试管等对物质具有吸附能力。特别是使用有机溶剂时，这种吸附更为严重。而且所用的溶剂极性越小，吸附作用越显著。在稀溶液分析中，器壁的吸附作用是不能忽略的。克服表面吸附的办法：（1）减少表面接触的机会；（2）使用非极性有机溶剂时，加入少量极性溶剂（如乙醇）；2、氧化作用：氧化作用是在稀溶液中很容易发生的现象，将造成荧光物质的损失而引起测定误差。微量氧化剂（包括溶解氧）的存在，会减弱物质的荧光。因此，实验所用的工作液应新鲜配制。对含有氧化剂的溶剂使用前应进行预处理。（1）尽量采用长波长的光进行激发；（2）操作过程避光，溶液和样品以黑纸包裹；（3）尽量缩短测定时间；（4）在测定允许的条件下，尽量调小激发光路的狭缝。（荧光显微技术-FITC的实际使用问题）3、光解作用：光解作用可能成为稀溶液分析的严重问题，对光不稳定的化合物尤其如此。解决办法：荧光强度可能由于许多过程的存在而减弱，这种荧光衰减现象称为荧光猝灭。猝灭可由不同机理而引起。激发态的荧光体与溶液中的被称作猝灭剂分子相互作用而被去活化，这种猝灭称为碰撞猝灭。此种情形下，荧光体通过与猝灭剂的扩散碰撞过程而返回基态，而分子在此过程不发生化学变化。（六）荧光猝灭猝灭剂的种类很多，如：氧气、卤素、胺、缺电子化合物如丙烯酰胺。猝灭机理因荧光体-猝灭剂的不同配对而异。荧光猝灭还可因其它一些过程而引起。荧光体可以和猝灭剂形成非荧光的复合物。这一过程称为静态猝灭。因为此过程发生于基态，且不依赖于扩散和分子碰撞。荧光猝灭还可因一些普通的非分子机理而引起，如荧光体自身或其它吸光型体的存在而导致入射光的衰减。（一）碰撞猝灭：溶液中荧光物质分子与猝灭剂分子发生碰撞而导致荧光强度降低。（二）组成化合物的猝灭：荧光物质分子与猝灭剂形成不发荧光的配合物。（三）转入三重态的猝灭：通过能量转移，激发单重态的荧光分子转入激发三重态，三重态的分子常温下不发光。（四）电子转移猝灭：猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生电子转移反应，即氧化还原反应而引起荧光猝灭。（五）自猝灭：包括自吸收、形成基态与激发态二聚体、基态缔合作用。荧光探针是建立在光谱化学和光学波导与测量技术基础上，选择性的将分析对象的信息连续转变为分析仪器以测量的荧光信号的分子测量装置。在紫外-可见-近红外区有特征荧光，并且其荧光性质（激发和发射波长、强度、寿命、偏振等）可随所处环境的性质，如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变，并借助于光导纤维进行光信号传递的装置。荧光探针受到周围环境的影响，使其发生荧光发射发生变化，从而使人们获知周围环境的特征或者环境中存在的某种特定信息。什么是荧光探针？荧光分子探针的优点灵敏度高选择性好使用方便成本低不需预处理不受外界电磁场影响远距离发光荧光分子探针的结构荧光分子探针通常由三部分组成：识别基团接收器（Receptor）荧光基团报告器（Reporter）连接器（Relay）识别基团决定了探针分子的选择性和特异性，荧光基团报告器则决定了识别的灵敏度，而连接器则可起到分子识别枢纽的作用。荧光分子探针的设计原理荧光分子探针的设计原理主要有以下几种：键合-信号输出法、置换法和化学计量计法。1、键合-信号输出法荧光连接体识别被分析物信号输出基团基团键合-信号输出法是指将探针中的识别基团和荧光基团通过共价键连接起来设计荧光探针的方法。当识别基团与被分析物结合时会引起荧光基团的化学环境发生变化，通过颜色的改变、光谱的移动、荧光强度的增减等现象来表现，这些变化可被裸眼或者仪器识别。这是目前为止在设计荧光探针中应用最广泛的方法。作为荧光基团的香豆素和作为识别基团的邻氨基苯硫醚以席夫碱相连，加入锌离子后，与硫醚上的硫原子、席夫碱上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到结构2，抑制了席夫碱上C=N键的旋转，实现了荧光从无到有的变化12基于键合-信号输出法设计的锌离子荧光探针2、置换法识别基团被分析物识别基团荧光基团结合荧光基团结合被分析物基于置换法设计的荧光探针该原理是利用识别基团分别与荧光基团和被分析物结合能力的不同来实现