琼脂糖凝胶电泳-原理-步骤-详细

李莉琼脂糖凝胶电泳AgaroseGelElectrophoresis上海交通大学医学院讲课内容概述1琼脂糖凝胶的特点2琼脂糖凝胶电泳的应用3影响迁移率的因素4琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白5上海交通大学医学院概述IntroductionGelElectrophoresis：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。特点（characteristic）：1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动2.电泳操作方法简便，电泳速度快3.分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰4.适用于生化，免疫等定性定量测定上海交通大学医学院琼脂糖凝胶（AgaroseGel）天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂果胶（agaropectin）AcidsulfateCarboxylicacidgroups上海交通大学医学院D-半乳糖3，6-脱水-L-半乳糖琼脂糖（Agarose）半乳糖及其衍生物构成的中性物质上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容概述1琼脂糖凝胶的特点2琼脂糖凝胶电泳的应用3影响迁移率的因素4琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白5上海交通大学医学院琼脂糖凝胶的特点（一）优点（advantage)1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定6.有热可逆性上海交通大学医学院（二）缺点(disadvantage)1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色4.与PAGE相比，分子筛(molecularsieve)作用小，区带少上海交通大学医学院讲课内容概述1琼脂糖凝胶的特点2琼脂糖凝胶电泳的应用3影响迁移率的因素4琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白5上海交通大学医学院琼脂糖凝胶电泳的应用ApplicationsofAgaroseGelElectrophoresis1.适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化2.临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测3.为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标上海交通大学医学院ThegelwithUVillumination,theethidiumbromidestainedDNAglowsorange上海交通大学医学院Digitalimageof3plasmidrestrictiondigestsrunona1%w/vagarosegel,3Volts/cm,stainedwithethidiumbromide.TheDNAsizemarkerisacommercial1kbpladder.ThepositionofthewellsanddirectionofDNAmigrationisnoted.上海交通大学医学院上海交通大学医学院讲课内容概述1琼脂糖凝胶的特点2琼脂糖凝胶电泳的应用3影响迁移率的因素4琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白5上海交通大学医学院影响迁移率的因素FactorsaffectingmigrationthesizeofthemoleculeconformationofthemoleculetheagaroseconcentrationofagelVoltage上海交通大学医学院Percentagaroseandresolutionlimits上海交通大学医学院讲课内容概述1琼脂糖凝胶的特点2琼脂糖凝胶电泳的应用3影响迁移率的因素4琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白5上海交通大学医学院琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白原理（Principle）血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。上海交通大学医学院(一)血清脂蛋白(lipoprotein)的组成ApoAApoBprotein：ApoproteinApoCApoDApoE甘油三酯（TG）脂类磷脂（PL）游离胆固醇（FC）胆固醇酯（CE）少量糖上海交通大学医学院上海交通大学医学院（二）分类1.按电泳法分乳糜微粒（chylomicron,CM）-脂蛋白（-lipoprotein）前-脂蛋白（pre-lipoprotein）-脂蛋白（-lipoprotein）上海交通大学医学院2.按超速离心法分乳糜微粒(chylomicron,CM)(0.94)极低密度脂蛋白(0.941.006)(verylowdensitylipoprotein,VLDL)中间密度脂蛋白(1.0061.019)(intermediatedensitylipoprotein,IDL)低密度脂蛋白LDL(1.0191.063)(lowdensitylipoprotein,LDL)高密度脂蛋白HDL(1.0631.21)(highdensitylipoprotein,HDL)上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院（三）结构特征CMVLDLLDLHDL甘油三脂胆固醇蛋白质带电量（Q）pH8.6为例颗粒大小（mm）密度电泳速度形态多多少少大低慢规则不规则少少多多小高快上海交通大学医学院pH8.6pI，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前上海交通大学医学院加样槽β前βαCMLDLVLDLHDL—+上海交通大学医学院临床应用：高脂蛋白血症的分型CMβ前βα正常Ⅰ型Ⅱa型Ⅱb型Ⅲ型Ⅳ型Ⅴ型上海交通大学医学院操作上海交通大学医学院玻璃片上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院预染色的标本上海交通大学医学院＋上样处玻片琼脂糖凝胶上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院上海交通大学医学院CM上海交通大学医学院正常参考值（百分比）α-脂蛋白30-40%前β-脂蛋白15%β-脂蛋白55%注意事项：①血清样品要新鲜②为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清上海交通大学医学院名词解释1.迁移率2.电渗3.电泳问答题1.影响电泳迁移率的因素有哪些？2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。复习思考题上海交通大学医学院参考书目《临床生物化学及生物化学检验》第三版人民卫生出版社周新主编《电泳》科学出版社何忠效张树政主编《蛋白质电泳实验技术》科学出版社郭尧君《蛋白质技术手册》科学出版社汪家政范敏主编