高效液相色谱法的应用的研究进展

1高效液相色谱法的应用的研究进展1武瑶(材料工程与科学学院应用化学1202，绵阳621000)摘要：综述了高效液相色谱法的原理方法及在各方面的应用，并对它的前景进行了展望。关键词：高效液相色谱法；应用；研究进展中图分类号：O657.7+2文献标识码：ATheResearchandDevelopmentofHPLC’sApplicationYaoWuAppliedChemistry1202,SchoolofMaterialsScienceandEngineering,SouthwestUniversityofScienceandTechnology,MianYang621000Abstract:TheHPLCwassummarized,thevariousaspectsofapplicationwastalkedabout,anditsprospectwasdiscussed.Keywords:HPLC;application;ResearchandDevelopment高效液相色谱法是色谱法中的一个重要分支，英文名称HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC，又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等[1]。20世纪60年代中期，人们从气相色谱法的高速和高灵敏度得到启发，在经典液相色谱法的基础上，采用高压泵，加快液相色谱法中液体流动相的流动速率，改进固定相，以提高柱效能，采用高灵敏度检测器，从而实现了分析速度快、分离效能高和操作自动化。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等科学领域中重要的分离分析技术。1高效液相色谱法的分离原理及应用范围高效液相色谱法以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入收稿日期：2015/5/03星期天作者简介：武瑶，女，西南科技大学材料科学与工程学院应用化学12022装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。按照固定相的性质不同可以分为以下几种。1.1液固色谱法液固色谱法是液相色谱法中最先发张起来的一种分离模式。液固色谱法的流动相为液体，固定相为多孔的固体颗粒物质吸附剂，在其表面具有活性的吸附中心，它是根据物质吸附作用的不同来进行分离的，其作用机制是试样分子与溶剂分子对吸附剂活性表面的竞争吸附。常用的液固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒性硅胶、氧化铝、分子筛（极性）和活性炭（非极性）等，由于硅胶柱具有高的柱效，试样容量大，并具有机械性能好、不溶胀、不与大多数试样发生化学反应等特点，因此是使用最普遍的一种色谱柱。液固色谱分离法最适宜分离那些溶解在非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。能分离多官能团化合物、稳定化合物、异构体等，如胺类、酚、醇、酰胺、增塑剂等，液固色谱不适用于强极性的离子型试样的分离，不适用与分离同系物。1.2液液色谱法又称液液分配色谱法，两相都是液体。一个液相作为流动相，另一个液相（及固定液）则涂渍在很细的惰性载体或硅胶上作为固定相，流动相与固定相应互不相溶，两者之间有一个明显的分界面。固定液对被分离组分是一种很好的溶剂，当被分析的试样进入色谱柱后，各组分按照它们各自的分配系数，很快的在两相间达到分配平衡，即液液分配色谱是根据组分在两相中的分配系数不同而进行分离的。若按照固定相与流动相之间相对极性的不同，液液分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法。正相液液色谱法，固定相的极性大于流动相的极性，它对极性强的组分有较大的保留值，常用于分离强极性化合物，例如胺类、酰胺、醇、酚、生物碱、农药、染料等；反相液液色谱法，固定液的极性小于流动相的极性，它对极性弱的组分有较大的保留值，适用于分离弱极性或非极性的化合物，例如多核芳烃、蒽醌、脂溶性维生素、酚醛树脂、增塑剂等。1.3离子交换色谱法离子交换色谱法是以离子交换树脂为固定相，树脂上具有可以交换的离子基团。当流动相带着组分离解生成的离子通过固定相时，树脂上可交换的离子基团与具有相同电荷的组分离子进行可逆3交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。凡在溶剂中能够解离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。它不仅广泛的应用于有机物质，还广泛用于生物物质的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质、药物及它们的代谢物、维生素的混合物、食品防腐剂、血清的分离等。1.4离子对色谱法离子对色谱法是将一种或多种与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质粒子结合形成离子对化合物，从而控制溶质粒子的保留行为，在色谱分离过程中，流动相中待分离的有机离子与固定相或流动相中带相反电荷的对离子结合，形成离子对化合物，然后在两相间进行分配。用于阳离子分离的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸南等；用于阴离子分离的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基铵等。离子对色谱主要用于能电离的或有离子性质的有机化合物或离子性和中和溶质的混合物的分离[2]，特别是反相离子对色谱法解决了以往难分离混合物的分离问题，例如酸、碱和离子、非离子的混合物，特别是一些生化试样如核苷、生物碱、儿茶酚胺、药物及核酸等的分离。1.5空间排阻色谱法空间排阻色谱法也称凝胶渗透色谱法，是一种按照溶质分子在流动相溶液中的体积大小分离的色谱法。固定相为凝胶，是一种表面惰性、含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状的物质，凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当，试样组分进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部空隙以及凝胶孔穴旁流过，大组分分子由于不能进入孔穴而被排斥，从而随流动相移动而最先流出，小分子组分可以渗透到孔穴内部，受到更强的直流，会更慢的被洗脱出来。空间排阻色谱法主要适用于分子量的差别在百分之十以上的物质的分离。可以应用于对未知试样的探索分离，例如测量聚合物的相对分子质量及其分布，聚合物的支化度、共聚物及共混物的组成，聚合物分级及其结构分析，高聚物中微量添加剂的分析等。2高效液相色谱法的应用2.1高效液相色谱法在食品分析上的应用食品是人类生存的必需品和能量来源，食品安全关系到人类的身体健康和生命安全，关系到经济健康和社会稳定，在食品生产过4程中，各种食品添加剂含量过高会影响人体健康，外界环境污染也会是食品沾污，因此食品分析很重要。高效液相色谱分析法比化学分析法操作简便，快速，融合了液相和气相两种分析方法的优势，因而功效更加明显，正在广泛的在食品检测工作中应用开来[3]。2.1.1食品添加剂分析食品添加剂是在食品生产加工过程中，为改善食品色、香、味等品质，以及为防腐和加工工艺的需要，而加入食品中的少量的化学合成或者天然物质[4]。食品添加剂可以分为天然食品添加剂与化学合成食品添加剂。化学合成食品添加剂如果添加不当或者在食品中发生转化则会对人体造成一定的危害。用HPLC分析食品添加剂是相当成熟的方法，，如梯度洗脱分析食品中的合成着色剂，等度洗脱分析食品中的防腐剂、抗氧化剂等[5]。阿布都外力•吐尼亚孜[6]通过反相高效液相色潽法同时测定十种食品添加剂、固相萃取-反向高效液相色谱法同时测定食品中12种添加剂、反向高效液相色谱法同时测定14种食品添加剂添加剂三个实验证明反相高效液相色潽法具有简便、检测时间短、多组分检测、准确、适用面广、易于掌握、分离效果好和使用高通量分析等优点，可以通过一次测定就达到对防腐剂、人工合成甜味剂等食品添加剂的定性、定量检测，并且适用于常规检测。2.1.2食品营养成分分析食物中有多种人体需要的营养成分，主要有糖、脂肪、蛋白质高、维生素、无机盐和水六大类。根据在机体内的作用，这些营养成分可以分为构成物质、能源物质和调节物质。蛋白质、无机盐和水是构成物质，糖和脂肪是能源物质，维生素是调节物质。朱群英[7]采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法同时测定食品中的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖含量，果糖、蔗糖、葡萄糖的线性范围分别为0.5～3.0g/L、0.5～5.0g/L、0.5～5.0g/L，具有基线稳定、分离效果好，结果准确、样品处理简单、测定速度快等优点，可作为评价食品中糖含量的有效方法。姜兰芳[8]以维生素A和E萃取率的平均值为检测指标，采用L18（37）正交试验法考察了萃取剂的类型、用量、分散剂的类型、用量以及萃取时间和离子强度6个影响因素，利用高效液相色谱法测定维生素的含量，维生素A和E在0.23～174μg/ml范围内线性关系良好，方法稳定可行。2.1.3食品污染物分析51983年，联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂法规委员会第十六次会议规定：凡不是有意加入食品中，而是在生产、制造、处理、加工、填充、包装、运输和贮藏等过程中带入食品的任何物质都称为污染物，但不包括昆虫碎体、动物毛发和其他不寻常的物质；残留农药也算是污染物。污染物可能有：化肥、农药、抗菌素、激素、药物和包装材料溶出物等。苏丹红是一种人工合成的染料，具有潜在的致癌性，测定苏丹红的方法主要是高效液相色谱法，张洁[9]利用廉价的甲醇作为流动相建立的高效液相色谱法，检测速度快，检出限低，实现了对苏丹红混合物（包括苏丹红Ⅰ-Ⅳ）的分离分析，测定苏丹红Ⅰ-Ⅳ的线性范围为0.01～40mg/L,相对偏差均小于百分之五，检出限在0.01～0.02mg/L之间，成功应用于环境水样和食品中苏丹红的分析测定，并且样品处理过程简单、快速。季铵盐表面活性剂是高产量化学品，广泛用于杀菌剂、药物和除草剂，柔顺剂，护发剂等，由于其毒性小，在食品及食品工业中广泛应用。曹海微[10]采用高效液相色谱法-串联质谱连用技术建立了食物中十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基二甲基苄基氯化铵、十四烷基二甲基苄基氯化铵、十六烷基二甲基苄基氯化铵以及二癸基二甲基氯化铵五种季铵盐残留分析检测方法，五种季铵盐在5.00～500.00μg/L范围内线性关系良好，相关系数均不低于0.995，方法定量限位10.00μg/kg。该方法样品前处理简单，分析时间短，灵敏度高，完全满足国内外检测量的需要。液质联用检测食品中农兽药残留量以及食品中其他有害物质都十分灵敏有效。高效液相色谱法分离痕量金属离子与有机试剂形成的稳定的有色衍生物，例如食品中的锌、铜、铅和镉，克服了光度分析选择性差的缺点，可实现多元素同时测定[11]。2.2高效液相色谱法在环境污染分析中的应用环境污染是指自然地或人为地向环境中添加某种物质而超过环境的自净能力而产生危害的行为，由于人为因素是环境的构成或状态发生变化，环境素质下降，从而扰乱和破坏了生态系统和人类的正常生产和生活条件的现象。在环境分析中，高效液相色谱法起着重要的作用，大部分有机污染物都能用HPLC来检测，如有机磷农药、有机氯农药、酰胺类除草剂、拟除虫菊酯杀虫剂、分类及其衍生物、工业染料等[12]。环境污染物中的重金属及农药残留检测一般是微量或痕量分6析，高效液相色谱法灵敏度高，分离效率高、应用范围广、分析速度快、样品用量少。王蕾蕾[13]通过浊点萃取-高效液相色谱法同时分离测定了Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）的研究以及固相萃取-高效液相色谱法连用拆分手性农药2,4-滴丙酸和2-甲-4氯丙酸的实验，实验结果良好，证明了高效液相色谱法的实用性以及不可替代性。2.3高效液相色谱法在医药研究中的应用医药是人类生活中必不可少的，高效色谱法由于它的高选择性、高灵敏度等特点，已成为医药研究的有力工具。例如定性、定量测定人工合成药物的纯化成分，中草药有效成分的分离、制备以及纯度测定，人体血液和体液中药物的浓度、药物代谢物的测定，新型高效手性药物对应体含量的测定等。杨远高[14]采用胶束萃取-高效液相色谱法测定虎杖中的白藜芦醇，白藜芦醇在0.04～200μg/ml，（r=0.9998）范围内线性关系良好定性检测限（S/N=3）为9.46ng/ml。肖燕[15]通过高效液相色谱法对四种降糖药物进行了快速的检测，并列出了药物的一阶导数相似度差值，数据表明一阶导数光谱相似度扩大了四种药物的差异性，有利于定性的准确。2.4高效液相色谱法在生物化学和生物工程中的应用生命科学和