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MicroRNA的研究进展microRNA生物学特征及功能microRNA的加工成熟microRNA的作用机制microRNA应用现状12345展望1.microRNA的生物学特征及功能RNA的分类(1)信使RNA(mRNA)(2)转运RNA(tRNA)(3)核糖体RNA(rRNA)(4)核酶(ribozyme)和其它RNA自我催化分子(5)基因组RNA(genomeRNA)(6)指导RNA(guideRNA)(7)非编码RNA(8)tmRNA(9)小胞质RNA(smallcytoplasmicRNA,scRNA)(10)小核RNA(smallnuclearRNA,snRNA)(11)核仁小RNA(smallnucleolarRNA,snoRNA)(12)反义RNA(antisenseRNA)(13)端粒酶RNA(14)小RNAmicoRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族，它们是由19-23个核苷酸组成的单链RNA（3‘端可有1~2个碱基长度的变化）microRNA的生物学特征microRNA广泛地存在于多种真核生物中，从低等生物到人类都有其存在的痕迹。其生物学特性主要表现为：高度保守性，时序表达特异性和组织表达特异性,以及miRNA独有的特征。高度保守性microRNA的序列结构在各个物种间具有高度的进化保守性，最具有microRNA保守性的是let-7，它广泛存在于两侧对称的生物体中，其序列保守性令人吃惊。科研人员认为，microRNA的保守性具有重要的生物学意义，提示在不同生物发育过程中，microRNA具有相同的调控机制，同时也为生物早期进化同源性提供了某种依据。时序表达特异性在不同组织、不同发育阶段中，microRNA的表达水平有显著差异。一些microRNA呈时间发育特异性表达，NeilsonJR等研究表明在细胞发育的不同阶段mRNA表达是动态调控的。AsonB等研究发现，不同物种间许多microRNA表现高度保守性，mRNA表达变化越大，生理差别越大。物种间的差别最主要是由于microRNA表达的异时性变化和较小程度的空间表达差异。由此，可以推测microRNA表达的变化可能在动物发育过程中形成生理差别是其作用。组织表达特异性一些microRNA表达具有细胞和组织特异性，如miR-17～20位于Hela细胞同一基因簇内，并在斑马鱼细胞中表达，但在鼠肾和蛙卵巢细胞中未检测到。这种特异性对microRNA的调控功能有重要意义。miRNA独有的特征：其5’端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏CmiRNA执行一定的生物学功能：•对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用；通过两种机制调节靶基因的表达:(1)结合到靶mRNA3′端非翻译区(3′UTRs),抑制其翻译;(2)像siRNA作用一样结合到靶上并降解靶mRNA。•一些偏大的miRNA(27nt)可能参与了基因组的重组；•参与生物的发育与多种生理、病理过程；2.microRNA的加工成熟miRNA的生成需要两个步骤：1)由长的内源性转录本（pri-miRNA)经Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前体(pre-miRNA)，该过程发生在细胞核2)将pre-miRNA经Dicer酶作用加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中microRNA的加工成熟首先由基因组转录形成长链RNA分子——pri-miRNAPri-miRNA经双链RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70-100nt长度的pre-miRNAPre-miRNA在Exportin5介导作用下转运出胞核至胞质中进行下一步加工Pre-miRNA在胞质中经双链RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成单链成熟miRNA分子3.microRNA的作用机制miRNA对靶基因的作用机制一直是众多研究人员的关注热点。最早发现的两个miRNA—lin4和let-7被认为是通过不完全互补结合到靶基因mRNA3’UTR，以一种未知的方式抑制蛋白翻译，进而抑制蛋白合成，阻断mRNA的翻译过程。后来的研究也发现，多个果蝇miRNA和它们的靶基因mRNA的3’UTR存在部分同源。但由于有miRNA与其目标靶之间的互补是不完全的。用生物信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点并非易事。在植物中，由于miRNA与潜在的靶基因是完全互补的，使得植物的miRNA靶预测相对较容易。但这些预测基因是否就是miRNA的靶基因，还需要作进一步验证。研究表明，microRNA基因是一类高度保守的基因家族，按其与靶基因的作用模式不同，主要可分为以下三种类型。1）作用时与靶基因完全互补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA，常见于植物；2）作用时与靶基因不完全互补结合，进而阻止翻译而不影响mRNA的稳定性，这是目前发现最多的作用模式，常见于动物。3）具有以上两种作用模式，当与靶基因完全互补结合时，直接靶向切割mRNA，当与靶基因不完全互补结合时，阻止靶基因的翻译。miRNA对靶基因的调控，正如前所述，pre-miRNA由exportin-5输出至胞浆中，然后释放pre-miRNA。pre-miRNA与Dicer互补结合，产生长度为22nt的不完全配对的双链RNA（dsRNA）。双链中的一条为成熟的miRNA，另一条则为它的互补链。最后，双链中成熟的miRNA与RNA诱导的RISC结合，随后与靶mRNA互补。而互补链没有结合RISC，因此在体内是趋于降解的。对miRNA来说，发挥对靶基因的调控作用，Dicer和RISC是必不可少的。因为Dicer是产生miRNA不可或缺的，而RISC则是miRNA实现功能的载体。miRNA介导的RISC简称miRISC（miRNA-containingRNAinducedsilencingcomplex），也被称作miRNA核糖核蛋白复合体（miRNP）。miRISC复合体除了包括成熟miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其他相关蛋白。其与RISC结合的原理与siRNA类似。以dsRNA为例，当双链中两根支链的稳定性相似或相同时，它们结合进入RISC的概率也相似或相同，因此称为等势结合。当双链中支链的稳定性相对较弱时，解旋酶会从稳定性弱的一支解开dsRNA，从而会偏向性地产生一条结合到RISC复合体上，这类结合称为优势结合，未进入RISC的互补链RNA会很快降解。3.1RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成RISC是miRNA参与靶基因调控过程中不可或缺的载体。在miRISC复合体中，Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联进行的。通常，只有一条链进入miRNA，具体选择双链中哪一条链取决于碱基热动力学稳定性因素等因素。不进入RISC的miRNA链被称之为伴随连（passenger），并被冠以星号（*），具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。但在某些情况下，两条链均具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能miRNA。RISC是具有多轮催化效应的酶。在这一过程中，其核心组分Ago2发挥重要作用。因此，在组成miRISC的蛋白质中，Ago蛋白家族成员在RISC功能中处于中心地位。3.1RNA诱导沉默复合体（RISC）的形成Ago家族蛋白为一类分子质量约为100kD的蛋白质，属于进化保守的家族，包含有PAZ和Piwi两个保守的RNA结合结构域，是目前唯一一种在所有RNAi和miRNA通路中均可发现的蛋白。Ago蛋白与miRNA结合使其朝向正确，以便与靶基因mRNA作用。Ago蛋白可能招募其他蛋白行使翻译抑制功能；一些Ago蛋白直接切割靶转录本。miRNA靶向互补mRNAs导致目的mRNA切割降解的过程被称为转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）。有效的PTGS需要RISC对mRNA转录本的切割。miRNA可以指导RISC在转录后水平下调基因的表达-mRNA的降解或翻译抑制。采取何种沉默方式是由mRNA的特性所决定的。如果mRNA能够与miRNA完全互补，该mRNA就会被RISC特异地降解；如果mRNA不能与miRNA完全互补，仅在某个位点与miRNA互补，那么RISC就不会特异地降解mRNA，只是阻止mRNA作为翻译的模板，使之不能合成蛋白质。3.2miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制的形成在动物中，多数情况下复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3’UTR不完全互补配对，从而阻碍对该mRNA的翻译，并以此来调控基因表达，但不影响mRNA的稳定性。如线虫中的miRNAlin-4就是以这种方式调控它的两个靶基因—lin-14和lin-28的翻译。另一种主要的作用方式则与siRNA诱导的转录后基因沉默的PTGS相类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago蛋白可通过对mRNA的切割直接导致其降解，完成基因沉默调控。3.2miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制的形成miRNA对翻译起始抑制的相关机制主要有如下一些观点：首先，mRNA可通过抑制核糖体的组装来阻断翻译起始，进而起到对翻译过程的抑制作用。miRNA的抑制作用需要靶mRNA具有m7G帽子结构成为支持这一理论的重要依据，由此推断miRISC可能通过对翻译起始复合物形成抑制而发挥作用。还有一些观点认为，通过影响靶mRNA脱腺嘌呤反应，导致其polyA尾缩短，从而使mRNA与polyA结合蛋白（polyAbindingprotein,PABP）受阻进而影响蛋白质翻译的起始。3.2.1miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制研究还表明，一些被miRNA作用后的mRNA可以与多核糖体偶联，这些核糖体在翻译中处于非常活跃度状态。此外，miRNA的抑制作用还可能发生在起始之后，这主要是由于其在翻译过程的抑制作用是通过内部核糖体进入位点（internalribosomeentrysite,IRES），而不是依赖mRNAm7G帽子来发挥作用。其他作用方式，比如对新生多肽链的翻译同步降解等目前还没有定论，有待进一步证实。3.2.1miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制miRNA可诱导与其不完全配对的靶mRNA衰减（降解）。通过Ago蛋白定位于如P小体（processingbodies,P-bodies）等的RNA颗粒（RNAgranules）中，这些颗粒中包含有mRNA降解的酶。这也可能是miRNA介导Mrna衰减的一个重要途径。3.2.2miRNA介导的mRNA衰减（降解）4.microRNA应用现状——癌症和发育中的miRNA3.1miRNA功能的发现过去20年，肿瘤遗传学家揭示了许多与肿瘤多步骤发生及进展相关的基因，这些研究都集中于传统的蛋白质编码基因，包括癌基因、抑癌基因以及维持基因组稳定的基因。在发现miRNA之前，人们一直认为基因组上的部分大片段未被翻译成蛋白质，所谓的“废物碎片”没有功能。而近十年来，越来越多的证据显示，小分子非编码RNA-microRNA（miRNA或miR），其功能失调与肿瘤发生密切相关，证明了miRNA是基因表达强有力的调控器。证据：①基因组计算分析显示约50000个miRNA存在于人类基因组中，每个miRNA在mRNA的3’端非翻译区的相同序列上都有着许多靶结合位点。②在已发现的1400多个miRNA中，超过50%的miRNA位于癌症相关的基因组区域内，包括脆性位点，经常发生缺失或复制的区域以及染色体易位的断裂点。例如：miR-125b-1（一种线虫microRNAlin-4的类似物）位于染色体11q24区域，而这一区域在一些肿瘤病人（乳腺癌，肺癌，卵巢癌，宫颈癌等）中的表达常常缺失。Sonoki等的研究认为，该基因与白血病的发生也有关系。越来越多的研究证实，这种长度约22nt的小分子RNA在植物和动物中广泛存在，具有很广泛的调控作用，是高等植物、动物生长发育的重要调节因子。植物miRNA最先于2