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实验四酵母菌的形态观察和显微直接计数法酵母菌是单细胞的真核微生物，个体比细菌大得多，细胞核与细胞质已有明显的分化。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。酵母菌的形态通常有球状、卵园状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。Saccharomycescerevisiae本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式，区分死、活细胞。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。一、实验目的和内容目的：了解酵母菌及其形态结构。内容：观察酵母菌个体形态、出芽方式，并区分死、活细胞。二、实验材料和用具酿酒酵母(Saccharomyescerevisiae)斜面菌种。0.05%美蓝染色液；显微镜、载玻片、擦镜纸、盖玻片、接种环三、操作步骤(1)取0.05%美蓝染色液1-2滴，置载玻片中央，并用接种环挑取少量酵母菌菌苔与染色液混匀，染色2～3min，加盖玻片(注意不要产生气泡)(2)在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。四、实验报告绘出酵母菌在高倍镜下的视野图操作录像微生物的显微直接计数法一目的要求1．明确血细胞计数板（血球计数板）计数的原理。2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二基本原理计数板是一块特制的厚玻璃片，玻片上有四个槽构成三个平台，中间的平台又由一短的横槽隔成两半，其上各刻有一方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。1.血球计数板2.盖玻片3.计数室A.正面图B.纵切面图一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数板之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，1mm1mm计数室的刻度一般有两种规格三试验材料菌种：稀释103倍的啤酒酵母培养液其他：显微镜、血球计数板、毛细管、盖玻片、吸水纸、擦镜纸等。四操作步骤1.检查血球计数板取血球计数板一块，先用显微镜检查计数板的计数室，看其是否沾有杂质或干涸着的菌体。若有污物则用少量脱脂棉沾95%酒精，轻轻擦洗，然后用水冲洗，再用吸水纸吸干（切勿用火焰烘烤），最后用擦镜纸擦干净。镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物时才可使用。2.稀释样品将培养后的酵母培养液振荡振摇混匀，然后作一定倍数的稀释。稀释度选择以小方格中的分布的菌体清晰可数为宜。一般以每小格内含4～5个菌体的稀释度为宜。3.加样取出一块干净盖玻片盖在计数板中央。用毛细管取菌稀释悬液注入盖玻片边缘，让菌液自行渗入，若菌液太多可用吸水纸吸去。（如有气泡须重做，且盖玻片不能上浮，菌液不能溢至盖玻片上方。）静置5—10分钟。4.镜检待细胞不动后进行镜检计数。先用低倍镜找到计数室方格后，再用高倍镜测数。一般应取上下及中央五个中格的总菌数。每个样品重复计数3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），取其平均值，按公式计算出每毫升菌液所含酵母细胞数。位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方及右方线上的菌体。凡酵母菌的芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数。5.清洗计数板用毕后，先用自来水轻轻冲洗，再用吸水纸吸干（切勿用火焰烘烤），最后用擦镜纸擦干净。切勿用硬物洗刷。五实验结果将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。各中格中菌数AB总菌数/个.ml-112345第一次第二次第三次平均值1mL菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）操作录像