单细胞测序技术-

单细胞测序技术小组成员：王小江吴贯召陈璇闫立娜过去二十几年里，随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。我们能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。另外有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基因组分析，因此全基因组测序遇到难题。背景单细胞测序主要涉及单细胞基因组测序和转录组测序两方面，分别针对单个细胞的DNA和RNA进行序列分析和比较，进而揭示基因组和转录组的变化。单细胞全基因组测序是对选定的目的细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后利用外显子捕获技术进而高通量测序。单细胞转录组测序是利用高通量测序技术进行cDNA测序，从而获取特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本单细胞测序技术是指在单个细胞水平上对基因组进行扩增与测序的一项新技术。优势：1.测量基因表达水平更加精确；2.能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA需要克服的难题：1.如何实现均匀扩增；2.全基因组覆盖问题；3.较高的扩增效率。单细胞测序技术的优势与技术难题用传统的随机引物PCR的方法来扩增，那么不同的扩增片段的扩增效率多少会有一些差异，这些扩增效率的差异会随着扩增循环数的增加呈现出指数放大的效果，其结果就是会发生严重的覆盖不均一，极少数区段的DNA被大量扩增，测序后它深度非常深，但在大多数区段只有很低的覆盖，甚至没有覆盖，那么我们就无法有效地判断那些低扩增效率区段的基因序列的情况；常规的、用大量的DNA建库的方法，因为打断、补平、加A、加接头等一长串的操作，每一步都会有DNA片段的损失，结果就是初始DNA中很大一部分会被浪费掉，而没有形成有效的文库分子，在单细胞测序中，丢失大部分的起始DNA是不可接受的。单细胞测序要求几乎所有的原始基因组片段都得到扩增，并且在后续的测序过程中被测序测到。这就要求几乎所有的片段都会被得到扩增，而不只是少数片段得到有效扩增；建好的文库在测序仪上机的时候，大约每上机2万个文库分子，只有1个文库分子，是能够在测序的Floecell表面生成簇，并且被测序测到的，剩下的大多数文库分子，在上机的时候是被水冲走的，所以单细胞基因组扩增的方法还要有较高的扩增效率，至少要有上万倍到几十万倍的扩增效率，才能保证在全基因组测序的时候，大部分的片段都被测序测到。MALBAC技术，首先需要进行5轮MDA预扩增，然后就可以使新获得的扩增产物形成闭合的环状分子。由于这些环状分子不能够被进一步扩增，所以整个扩增过程就变成了线性扩增。然后再进行常规的PCR扩增，由于此时采用的模板更加均一，所以在进行PCR扩增时就不易造成较大的差异。两种扩增技术：MALBAC方法和MDA方法MDA方法是使用随机引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用一种特定的聚合酶，这种聚合酶能够置换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构，扩增出大段的DNA。基因组模板DNA扩增引物Phi29DNA聚合酶MALBAC法扩增5’端有通用扩增序列的DNA片段第一个循环下来，得到的是一批5’端有通用扩增序列的DNA片段5’端有通用序列，3’端有与通用序列互补的序列的DNA片段在第二个循环完成后，所产生的扩增产物中大部分是5’端有通用序列，而3’端有与通用序列互补的序列的这些片段共循环5次58℃退火MALBAC的巧妙之处，就是在每个循环的最后，加了一步58度退火，这一退火过程，他让完整扩增的产物的两端发生链内杂交58℃退火链内杂交完整扩增产物，自我锁定，无法扩增这样3’端的序列就不能与新的、游离的引物发生杂交，也就不会引发新的、发始于3’端的扩增，这样就避免了完整扩增产物的指数扩增随机引物随机扩增现在，还是8个随机序列的引物在模板上随机地找结合位置，所有的位点都有一样的机会被扩增。这样得到的产物分三种线性扩增第二个要解决的难题，这里是利用Phi29聚合酶能一次在模板上聚合出多个新链的功能来达到这个目的。在5轮的扩增之后，每个模板都会有5*n2个扩增片段，这样就可以保证建库时大多数的基因组区域可以被建成文库，最后可以被测序测到。第三个要解决的问题，高效率扩增，还是利用了Phi29聚合酶的一次得到多个扩增片段的效果来达成的。MDA方法的技术核心是用Phi29DNA聚合酶来进行直接的扩增，Phi29DNA聚合酶可以把双链DNA进行解链，然后在常温条件下就把原始模板进行大量扩增MDA扩增图MDA的特点：扩增效率更高，实验方法简单MALBAC的特点：扩增均一性更好；得到的扩增DNA的量相对较少，或者说他的扩增效率相对较低两种方法比较应用（1）在胚胎植入前进行基因拷贝数变异检测；（2）进行肿瘤的染色体变异研究目前最主要的2个应用：在有习惯性流产的夫妇当中，最常见的病因就是染色体的平衡易位，所谓染色体平衡易位也就是A染色体的一段移到了B染色体上要把这个正常的受精卵挑出来，目前最有效的解决手段是做受精卵植入前检测，那么具体的操作方法是先做人工授精，在受精卵发育到8个细胞的时候，通过显微操作抓一个细胞出来测序，在这个测序过程当中就要用到MDA方法或MALBAC方法进行扩增、建库、测序，挑出那个好的受精卵，植回到母亲的子宫中去，长成一个正常的新生儿，这个就是受精卵植入前基因检测，如果夫妻一方有染色体易位，那么这对夫妇的受精卵中，每4个受精卵可能只有一个是正常的胚胎植入前进行基因拷贝数变异检测请大家批评指正！谢谢！