7-3第七章食品微生物检验-大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌计数

三、大肠菌群计数（一）大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌1、大肠菌群在一定培养条件下(一般是37℃24小时)能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。（GB4789.3—2010）大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、枸橼酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。2020/11/1522、粪大肠菌群•根据生长温度的差异，将能在37C生长的称为总大肠菌群，而在44.5C仍能生长的大肠菌群称为耐热大肠菌群(thermo-tolerantcoliformgroup)或粪大肠菌群（faecalcoliformFc），在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠艾希氏菌，但也包括克雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。3、大肠埃希氏菌（也称大肠杆菌）•分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大肠艾希氏菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。产气克雷白氏菌ETECEIECEHEC产气克雷白氏菌O157：H7大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。4.大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系5.大肠艾希氏菌的生物学特性（1）基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。（2）培养特性：A.大肠艾希氏菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46℃。B.在普通营养琼脂上有3中菌落形态：1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝；3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。C.大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征：大肠杆菌呈黑色中心,有或无金属光泽.6.大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠杆菌的卫生学意义1)大肠菌群和大肠艾希氏菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。第一，它可作为粪便污染食品的指示菌，第二，它可以作为肠道致病菌污染食品的指示菌。当食品中检出的大肠菌群数量多，肠道致病菌存在的可能性就愈大。2)大肠菌群中包含的菌种可以在人、畜粪便中检出，而其检测方法简单，计数容易，菌群中包括的菌种类多，检出几率高，但有少数菌种可在营养丰富的水体、土壤、腐败的植物等外环境中检出，即在非粪便污染的情况下，也有检出符合大肠菌群定义细菌的可能性，故在结果分析时应当慎重。而耐热大肠菌群的菌绝大多数均为埃希菌属的成员，更能表示样品被粪便污染的情况。3)大肠艾希氏菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠艾希氏菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。4)大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。作为粪便污染的指示菌，大肠埃希菌检出的意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群的检出意义略差一些。5)大肠菌群常用表示方法：最可能数-MPN（mostprobablenumber）/100mL。1.大肠菌群计数方法类型A.MPN计数法（最可能数法）(GB4789.3—2010，GB/T5750.12—2006)最常用的，适合于各类样品。B.平板计数法(GB4789.3—2010)大肠菌群数量较多的样品可使用C.滤膜法(GB／T5750.12～2006)主要用于生活饮用水、瓶装水和其他清亮液态样品。D.测试片法(纸片法)(GBl4934—94)常用于餐具大肠菌群检测。（二）大肠菌群计数2.食品微生物学检验大肠菌群计数（GB4789.3—2010）第一法：大肠菌群MPN计数法第二法：大肠菌群平板计数法3.MPN法原理•当欲对样品中某种细菌进行选择性计数时，由于样品中混有其他细菌，无法采用平板菌落计数的方法进行计数，在这种情况下可用MPN法计数菌数，特别是对菌数少的样品进行选择性计数很有用处，因为倾注平板法和表面涂布法计数的加样量分别为lml和0.1ml。•最常用的MPN法是多管发酵法对水和食品中的大肠菌群的计数。该法还可用于计数粪大肠菌群、产气荚膜梭菌等。•最可能数(mostprobablenumber，MPN)法是基于泊松分布的一种间接计数方法，又称为多管发酵法，是采用多次稀释直至无菌(multipledilutiontoextinction)的方式进行。首先将被检样品尽量混合或研磨，使其中的细菌分布均匀，混合的样品通过系列稀释和等量分配为小样品，有些小样品最后含菌量极少，或不再含有待测的目的细菌；分别接种不同的小样于相应的培养管，培养后观察有无目的菌生长，查用概率计算方法制成的MPN检索表，推算原始样品中待测细菌的可能数。•大肠菌群MPN法是利用大肠菌群细菌能分解乳糖产酸产气的特性进行检测即对未知样品做连续的10倍稀释，选择3个连续的10倍稀释液，每种稀释液接种3管装有培养基的试管中培养，根据LST初发酵试验以及BGLB发酵证实实验，证实大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数。•食品中大肠菌群数以每g（mL）样品中大肠菌群的最可能数来表示，即为大肠菌群MPN值。4.仪器设备•除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：–恒温培养箱、恒温水浴箱、均质器、振荡器、无菌吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、无菌培养皿、菌落计数器等。5.需要用到的培养基（1）LST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成分：胰蛋白胨或胰酪胨（Tryticase）20g，NaCL5.0g，乳糖5.0g，K2HPO42.75g，KH2PO42.75g，月桂基硫酸钠0.1g，蒸馏水1000mL。制法：将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。（2）BGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤成分：蛋白胨10.0g，乳糖10.0g，牛胆粉溶液200mL，0.1%煌绿水溶液13.3mL，蒸馏水800mL，pH7.2±0.1。制法：略抑菌剂的选择•大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。•抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。•抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。10-210-310-4大肠菌群的检验程序0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（-）小导管里无气泡LST产气（+）1）样品的稀释（1）称取25g样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。（2）样品匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠NaOH或1mol/L盐酸HCl）调节。（3）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。6.操作步骤1）样品的稀释（1）固体和半固体样品-称取25g样品，放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min-10000r/min均质1min-2min，或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min-2min，制成1:10的样品匀液。（2）液体样品–以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分棍匀，制成1:10的样品匀液。6.操作步骤（3）样品匀液的pH值应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCI）调节。（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。2）初发酵试验每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。LST结果判断•大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。3）复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。接种样本大肠菌群MPN法测定的操作流程•根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。•注意：当检样的量与表中的量有增加或减少时，表内的数也应相应减少或增加。