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11、癌发生的二阶段学说绝大多数肿瘤的发生都是一个受多因素作用，表现为多阶段的复杂过程，癌发生的二阶段学说是指癌变至少由两个既有区别又有联系的阶段构成，第一个为特异性的激发阶段，由使用一次小剂量的致癌物所引起，使正常细胞变为潜伏性瘤细胞。激发过程是正常细胞经致癌物作用后转变为潜伏性瘤细胞的过程，比较短暂，一般是不可逆的，已证实大部分致癌物为诱变物，因此，激发过程具有诱变性质，即涉及到遗传突变。第二个阶段为比较非特异的促进阶段，由巴豆油等促癌物促成，使潜伏的瘤细胞进一步发展成为肿瘤。现已证明，这个过程见于肝、肺、膀胱、食管、乳腺、胃、胰腺癌。促进过程的初期具有可逆性，而后期是不可逆的，促癌物本身不具诱变性，促癌过程是被激发细胞进一步增殖，逐步形成克隆的选择过程，在这一过程中激发细胞生长失控，逃脱宿主免疫监视，逐步形成恶性表型，继而发展成浸润、转移性癌。2、基因突变的方式与原癌基因活化1）点突变：是导致癌基因活化的主要方式，例如H-ras基因第12位密码子GGC变为GTC，从而使编码的甘氨酸变为缬氨酸，使其产物P21蛋白发生改变导致ras基因活化。2）DNA扩增：一些基因通过不明原因复制成多拷贝以游离形式存在称双微体，或再次整合入染色体形成均染区，一般表示高度的染色体结构破坏与不稳定性，基因考贝数增多往往导致表达水平增高，一般认为，基因扩增和过量表达均可影响细胞的正常生理功能。3）染色体重排：比如淋巴瘤第8号染色体与第14号易位，慢粒9号与22号易位等。这种异常表达导致细胞的增殖和分化异常。4）癌基因甲基化改变：DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能的异常，是细胞癌变过程中重要的一步。DNA甲基化有重要的生物学意义：控制基因表达，维护染色体完整性、调节DNA重组、抵御外来DNA入侵等。低甲基化导致一些正常情况下受到抑制的癌基因或相关因子得到大量表达，另外，也会导致整个基因组的不稳定性增加。癌基因DNA甲基化水平越低，其表达水平越高，肿瘤的生物学特性越复杂。因此，DNA甲基化状态的分析有可能成为判断肿瘤生物学特性及临床预后的重要指标之一。5）基因过量表达：基因表达水平改变是细胞癌变的早期事件，Met基因过量表达主要发生胃癌、异型增生和肠上皮化生；Ras过量表达出现在慢性萎缩性胃炎、肠化、异型增生及胃癌中，是细胞增殖活跃的指标。提示基因表达水平改变是癌变的一个重要因素。23、P53基因生物学特性与意义P53基因编码53kd的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合功能。是细胞周期中负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、凋亡等到有关。分为野生型和突变型。是最重要的抑癌基因。1)野生型p53蛋白具有反式激活功能和广谱肿瘤抑制作用。2)p53蛋白具有转录调节作用。3)可正调节一些在细胞增殖周期调控起关键作用的基因，包括可调节CDK活性的p21和DNA损伤导致细胞生长受阻相关的GADD45基因。4)在细胞内的核心作用是介导DNA损伤后的细胞应激反应，维持遗传稳定性。5)在G1/S控制点起作用，决定细胞是否启动DNA合成或凋亡。6)突变型p53具有癌基因作用。7)当病毒蛋白与p53蛋白形成复合物时，使p53蛋白含量显著增加，增强细胞的增殖能力。4、信号传导通路的组成基本组成：细胞外因子、受体、联结蛋白、G蛋白、第二信使、胞内激酶、核受体。1)细胞外因子（一）刺激细胞生长的因子：1、生长因子：⑴受体具有酪氨酸激酶活性；⑵特异性，⑶多样性，⑷家族性，⑸交叉性。2、细胞因子：白介素、干扰素等，受体不具有激酶活性。3、激素、神经递质：通过G蛋白联结受体传递信号，如生长激素、乙酰胆碱等。（二）其他：抗原、肿瘤坏死因子TNF，粘附分子：纤粘连蛋白，胶原蛋白2)受体（一）酪氨酸激酶受体：大多数生长因子受体，具有酪氨酸激酶活性。有上皮生长因子受体、胰岛素受体、血小板衍生的生长因子受体家族、纤维细胞生长因子受体、神经生长因子受体家族、肝细胞生长因子受体家族（二）G蛋白联结受体：大多激素、多肽、神经递质。有7个跨膜区，膜内区与G蛋白相偶联，传导信号。（三）细胞因子受体：淋巴细胞表面受体，白介素受体、诱发细胞凋亡受体（FasTNF受体）（四）粘附因子受体：cadherins,integrins,Ig超家族。3)联结蛋白SH2区：特异性结合磷酸化的酪氨酸，使酶定位到膜上，以靠近它的底物；促使底物靠近催化酶并定位；直接调节酶的活性。使蛋白与蛋白之间作用更有效地进行，信号顺利传递下去。SH3区：识别与结合脯氨酸富集区，也能使蛋白定位于相应的区域，调节并激活酶的活性。PH区：与介导G蛋白的βγ亚单位的生物功能以及与PIP2磷脂结合有关。DD：DD介导细胞内的Caspase系统和其他激酶通路。4)G蛋白分为经典G蛋白和小分子量G蛋白。在细胞生长、分化、细胞骨架、蛋白转运方面发挥重要的作用。Ras蛋白也是一种G蛋白，与GTP结合后具有生物活性，发生12位突变后的Ras蛋白，持续停滞在GTP活性状态，过度激活细胞内的许多通路，从而造成细胞3生长调控紊乱。5)第二信使指由刺激细胞生长的生长因子与受体结合后在细胞内产生的具有生物活性的一些小分子，主要有cAMP、cGMP、DAG、PIP3、Ca离子.大多通过激活G蛋白联结受体产生。CAMP激活PKA，cGMP激活PKG，DAG激活PKC，Ca++与钙调蛋白结合后，能激活许多激酶。6）胞内激酶MAPK是丝氨酸/苏氨酸激酶，MAP激酶是MAP激酶传导通路中的重要中继站和枢纽，平位于胞浆内，被激活后运到细胞核内，或直接激活转录因子，或激活另外一些激酶，启动或关闭一些特定基因的转录，对刺激信号作出必要的反应，调节细胞的正常生命活动。7）核受体有些激素如性激素通过核受体传导信号，这类受体位于胞浆内，当配体与之结合后，形成二聚体，转运到核内，核受体大多本身可以是转录因子，进入核内后直接调控某些基因的表达。5、凋亡的特点及生物学意义凋亡的特点细胞凋亡分为形态学特征和生物化学特征。其中形态学特征有形态上首先变圆，随即与邻近细胞脱离，失去微绒毛，胞质浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高呈半月形，并凝聚在核膜周边，核仁裂解，进而胞膜内陷，自行分割为多个外有膜包裹、内涵物不外溢的凋亡小体（apoptosisbody），最终被相邻的细胞所识别、吞噬或自然脱落而离开生物体。生物化学特征表现为：1、非随机性DNA降解；2、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻；3、保持充足的能量代谢直至细胞凋亡末期；4、半胱天冬蛋白酶（Caspase）的活化凋亡的生物学意义1）对生物体的发育和稳态的维持是至关重要的，尤其是在胚胎发育造型、细胞数量的精确控制和具潜在危险性的细胞的清除等发挥重要作用。2)细胞DNA损伤可诱导p53表达，使细胞停滞于G1期，以便提供时间修复，修复无能则触发细胞凋亡。3)凋亡与衰老也密切相关，随年龄增长，许多细胞失去凋亡能力，可能导致衰老与器官功能下降的重要原因。6、肿瘤多步骤转移基本过程1)早期原发癌生长：所需养料通过邻近组织器官微环境渗透提供。2)肿瘤血管形成：当肿瘤直径超过1~2mm时，通过微环境渗透提供的营养物质已不能保证肿瘤的生长，此时，宿主组织血循环形成的毛细胞血管网进入肿瘤组织，肿瘤血管逐步形成。3)肿瘤细胞脱落并侵入基质：部分肿瘤细胞分泌一种物质抑制粘附因子表达，增加肿瘤细胞运动能力，使其从原发灶脱离成游离细胞，并分泌各种蛋白溶解酶，破坏细胞外基质，从而突破结缔组织形成的屏障。4)肿瘤进入脉管系统：新生毛细胞血管基底膜本身存在缺损，薄壁小静脉的壁也有缝隙、微小淋巴管等结构为肿瘤细胞进入循环提供条件5)癌栓形成：进入血循环的肿瘤细胞大多数被杀死，只有极少数转移倾向极高的细胞形成癌栓在循环系统中存活下来。6)继发组织器官定位生长：循环中幸存的癌细胞到达继发组织器官后穿透血管进入周围组织，在各类生长因子作用下增殖生长，最终形成转移肿瘤灶。7)转移癌继续扩散：当转移灶直径超过1~2mm时，新生毛细血管形成并与肿瘤连通，又4开始新的转移过程7、基因突变形式的几种检测方法1)PCR-SSCP法：是在非变性聚丙酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依期碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。方法简便快速，适合大样本筛选。2)杂合双链分析法：由于突变型和野生型DNA形成异源杂合双链DNA在其错配处形成一突起，在非变性凝胶中电泳时会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率。3)突变体富集PCR法：基本原理是利用Ras基因某个编码子部位存在已知的限制性内切酶位点，用连续2次巢式PCR扩增包括K-ras第12、13编码子的DNA片断，在两次扩增反应之间用相应内切酶消化，野生型因被酶切不能进入第2次扩增，而突变型则能完整进入第2次PCR扩增并得到产物的富集。4)变性梯度凝胶电泳法：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，则因影响电泳速度变化的程度从而被分离。5)化学切割错配法：将待测DNA片断与相应的野生型DNA片断或DNA和RNA片断混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。检测片断最长的方法。6)等位基因特异性寡核苷酸分析法（ASO）：以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片断，其中包含了突变部位，以此为探针，与固定在膜上的样品DAN杂交。7)连接酶链反应：是以DNA连接酶将某一DNA链的5’-磷酸与另一相邻3’-羟基连接为基础，应用二对互补的引物，双链DNA经加热变性后，二对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶作用下，使相邻两引物的5’-磷酸与3’-羟基形成磷酸二酯键而连接，如果配对碱基存在突变则不能连接和扩增。8)等位基因特异性扩增法：用于对已知突变基因进行检测，通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。9)RNA酶A切割法：一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产生可通过变性凝胶电泳分离。10)染色体分析：主要有荧光原位杂交技术、PRINS法和比较基因组杂交技术。11)DNA序列分析：原理是双脱氧终止法，现可自动化测序。12)DNA芯片：基于杂交测序技术基础上建立起来的。将制备好的DNA片断排列在固相载体上，可用于基因定位、DNA测序、基因制图、基因功能分析和遗传图谱的构建等，还可以寻找和发现新的基因。8、化疗药物多药耐药性发生机制多药耐药性又称多向抗药性，是指恶性肿瘤细胞在接触一种抗癌药后，产生了对多种结构不同、作用机制各异的其他抗癌药的抗药性。多出现于天然来源的抗癌药如：长春新碱类、紫杉醇类和蒽环类抗生素。共同特点是：一般为亲脂性药物，分子量在300-900道尔顿之间，药物进入细胞的方式是被动扩散，药物在MDR细胞内积聚比敏感细胞少，导致胞内药物浓度不足未能发挥细胞毒性作用。MDR细胞膜上有一种特殊的蛋白，P-gp，编码此蛋白的基因扩增。P-gp具有膜转运蛋白的许多结构特征，一旦与抗癌药物结合，通过ATP提供能量，将药物从胞内泵出胞外，抗癌药物浓度在胞内不断下降，其细胞毒性作用不断减弱或消失，出现耐药现象。近年来还发现多药耐药相关蛋白家族（MRPs）和乳腺癌耐药蛋白（BCRP），5他们与P-gp都属于ATP结合盒（ABC）膜转运蛋白超家族。9、基因治疗策略离体基因治疗：将目的基因在体外导入自体或异体来源的肿瘤细胞、免疫细胞或其他细胞，再将它们转入体内。原位基因治疗：将目的基因载体直接注射或导入人体内的肿瘤组织，进行局部性基因治疗。体内基因治疗：将目的基因载体注射到血液系统进行全身性的基因治疗。一、目的基因及其作用1、调节机体