聚丙烯酰胺凝胶电泳

2020年11月15日星期日聚丙烯酰胺凝胶电泳1、作用分离蛋白质、核酸2、概念聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好、有弹性、透明、化学性质稳定、对pH和温度变化小、没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下合成。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）3、原理（1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺PAGE的聚合需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。（1）化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-。注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合（2）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据亚基分子量分离蛋白质）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳概述1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善。他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视。基本原理1.蛋白质分子的解聚(1)SDS（十二烷基硫酸钠，sodiumdodecylsulfate,SDS)阴离子去污剂变性剂助溶性试剂断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构(2)强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。实验原理--------------------------------------SDS和还原剂的作用：（1）分子被解聚成组成它们的多肽链（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS胶束的特点：（1）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。2.凝胶浓度的选择由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。PAGE的浓度与孔径的关系PAGE孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。Acr/Bis：20~40完全透明且有弹性；＜10很脆，易碎，不透明；＞100糊状不成形，易破碎。凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和Bis的总克数。T=（a+b）/m×100%T越大，凝胶孔径越小，适用于分离分子量较小的物质。T越小，凝胶孔径越大，适用于分离分子量较大的物质。C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。C=b/（a+b）×100%当T固定时，Bis浓度在5%时孔径最小。3、分类按具体操作分垂直板形电泳圆盘电泳按凝胶系统的均匀性分连续PAGE不连续PAGE电泳体系中所用的缓冲液成分、pH、凝胶浓度相同缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好，分辨率高，是最常用的体系。电荷效应分子筛效应浓缩效应：不连续性所致连续电泳不连续电泳PAGE电荷效应分子筛效应不连续SDS-PAGE1.原理凝胶的不连续性缓冲离子的不连续性pH的不连续性电位梯度的不连续性分离胶pH8.9浓缩胶pH6.7①凝胶的不连续性：浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。②缓冲离子的不连续性③pH的不连续性④电位梯度的不连续性制胶缓冲液：Tris-HCl浓缩胶pH6.7分离胶pH8.9电泳缓冲液：Tris-甘氨酸在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而Cl—却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。实验过程凝胶制备样品处理与加样电泳剥胶与固定染色与脱色安装电泳槽勇于开始，才能找到成功的路实验步骤一、制胶1.配胶配胶应根据所测蛋白质相对分子质量范围选择适宜的分离胶浓度。由于SDS-PAGE有连续体系和不连续体系两种，两者各有不同缓冲体系，因而有不同的配制方法。（以不连续体系为例）蛋白质的相对分子量的范围分离胶的浓度＜10420%～30%1×104～4×10415%～20%4×104～1×10510%～15%1×105～5×1055%～10%＞5×1052%～5%试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis）----3.0浓缩胶缓冲液（pH6.8Tris-HCl）----1.2510%SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.002.00重蒸馏水11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10%AP0.100.100.100.100.052.分离胶的制备胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水加速聚合→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。3.浓缩胶的制备用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→静置，聚合。二、样品处理与加样1.样品处理2.加样小心拔出梳子上下槽注入电极缓冲液用微量进样器点样三、电泳接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开开关，保持恒压进行电泳。样品溶解沸水浴冷却加样样品迁移方向样品溶解液电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图混合样品带孔胶按分子大小分离电泳方向电泳小分子大分子流程图结果分析1.相对迁移率的计算相对迁移率mR=蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图2.标准曲线的绘制以每条Marker带的相对迁移率为横坐标，相应分子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图分子量相对迁移率3.未知蛋白质样品分子量的测算计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。如图在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。标准蛋白分子量未知蛋白相对迁移率SDS-PAGE测定蛋白质分子量示意图注意事项1.SDS的纯度：市售SDS(A.R.)需重结晶后再用。2.SDS与蛋白质的结合量：大多数1.4gSDS/g蛋白质影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：(1)溶液中SDS单体的浓度(2)样品缓冲液的离子强度(3)二硫键是否完全被还原3.凝胶浓度：应根据位置样品估计相对分子质量，选择适当的凝胶浓度。测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，不能利用这次的标准曲线作为下次用。4.多亚基蛋白的分子量：有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，SDS-PAGE测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。5.特殊蛋白质的相对分子质量：不是所有的蛋白质都能用SDS-PAGE测定其分子量。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。6.对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。Native-PAGE和SDS-PAGE的比较与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性。最主要的有以下几点：1.凝胶的配置中非变性凝胶不能加入SDS，而变性凝胶有SDS。2.样品缓冲液中非变性凝胶不仅没有SDS，也没有巯基乙醇。3.在非变性凝胶中蛋白质的分离取决于它所带的电荷以及分子大小，而SDS-PAGE电泳中蛋白质分离只与其分子量有关。4.非变性凝胶电泳中，酸性蛋白和碱性蛋白的分离是完全不同的，而SDS-PAGE中所有蛋白都朝正极泳动。5.在非变性凝胶电泳中，电流不能太大，以免电泳时产生的热量太多导致蛋白变性。这点跟变性电泳也不一样。所以与SDS-PAGE电泳相比，非变性凝胶大大降低了蛋白质变性发生的机率。