DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μMDNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。1.取7.3μlaptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；2.于不同时间点（6h,5h,4h,3h,2h,1h,1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3.用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4.取上清到新的EP管中。在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5.用15000转/分离心10分钟，收集上清；6.重复4、5步直到上清澄清；7.在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8.加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9.重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10.加入1/10体积的3MNaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11.用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12.将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。）13.在管中加入16μL1*TE溶液；14.进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。聚丙烯酰胺凝胶电泳------注意实验中戴好手套！！！1.准备：清洗干净玻璃板、凉干！装好电泳的玻璃板（用1.5mm的厚玻璃板）；有凹槽的一面向内！！压紧，避免漏液！2.配胶：20%变性聚丙烯酰胺凝胶8ml：称取尿素3.36g，加入45%丙烯酰胺溶液3.56ml，5×TBE1.6ml，加热使尿素溶解（可用55℃水浴加热），通过10ml量筒加水至8ml，轻混匀后放在冰上冷却（溶液温度较高时，加入催化剂后将迅速凝胶，甚至来不及灌胶），加入3-6μlTEMED（助催化剂）、10%过硫酸铵60μl（催化剂）。催化剂过多可能导致来不及灌胶就凝胶！！3.灌胶：加入TEMED和过硫酸铵后，用tip头轻搅混匀，迅速灌胶；灌胶应当一次性、顺畅地完成，避免形成断层！插上梳子，约30分钟成胶（观察梳孔间的凝胶情况）；4.垂直小心地拔出梳子，小心产生气泡；拿掉玻璃板底下的防漏胶带！重新装好玻璃板！注意有凹槽的一面向内！！5.用超纯水、1×TBE溶液冲洗加样孔（很重要，若没有清洗干净，将影响电泳）；加满整个梳孔后用滤纸吸干即可。6.将电泳槽及电泳装置灌满1*TBE缓冲液（盖过凝胶）；7.上样：取8μl样品和2μlloadingbuffer混匀，用10μl微量注射器加样（方便伸入加样孔）；8.电泳：先用40V电压电泳1小时，再用80V电泳约3-4小时，至溴酚兰带（loadingbuffer中一般含有2种指示剂，跑的较慢的青兰色是二甲苯氰，跑的较快的蓝色是溴酚兰）跑至胶的1/2-2/3，停止电泳；（在不同浓度的胶中，溴酚兰电泳的速度可与某长度的核酸相当，参见我电泳的资料或者李伟师姐的实验书）；电泳过程中会产热而影响电泳效果，可以将电泳装置置于冰盒中，注意保持水平！！9.染色：小心取出凝胶，放在合适的培养皿中，用1×SYBRGold（至少30ml）避光、在摇床中染色20分钟（室温还是？？）（第2次染色30min，第3次40min，建议SYBRGold最多重复利用3次。）10.成像：用凝胶成像系统成像。开机密码：123456。[溶液的配制]Bindingbuffer在D-PBS中加入：葡萄糖+MgCl2+BSA(在307超高速离心机旁冰箱的柜门中间栏)；混匀后取部分加入10%胎牛血清；剩下溶液中加入10%NaN3(在307超高速离心机旁冰箱的4℃最上层的左边最里面)，混匀，为Washingbuffer。苯酚-氯仿Tris饱和苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1配制方法：将Tris-Hcl平衡酚与等体积的氯仿/异戊醇（24:1）混合均匀后，移入棕色瓶4℃保存。45%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺：43.4g加水定容100ml，用一次性滤头过滤，保存于棕色瓶中。N,N-亚甲基双丙烯酰胺：1.6g（可加热至37℃促进溶解）(丙烯酰胺单体具有很强的神经毒性，可通过皮肤吸收且具有累积效应，配制过程中应严格戴手套实验服；聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作。)0.5MEDTA，50ml称取Na2EDTA.2H2O（372.24g/mol）9.306g，加水40ml后边搅伴边加NaOH（浓NaOH或者固体NaOH1g左右！）调pH值至8.0（EDTA将逐渐溶解，若pH值到8.0后仍有少量不溶，可适当加热），定容至50ml。高温高压灭菌，室温保存。5×TBETris：27g硼酸：13.75g加水至500ml。（用橡胶塞做瓶盖）0.5M的ETDA（pH8.0）：10ml（5*TBE是配胶时用的，电泳时所用的缓冲液是1*TBE浓度！）0.05M的Tris-HCl，pH8.0，100ml称取Tris0.6057g，加水至80ml后，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100ml。高温高压灭菌，室温保存。1*TE溶液，pH8.0，100ml0.05MTris：20ml加水至100ml。高温高压灭菌，室温保存。0.5METDA：200μl3MNaAc,pH5.2,50ml称取NaAc·3H2O（136.08g/mol）20.412g，用冰醋酸调pH值至5.2，定容至50ml，高温高压灭菌后使用，室温保存。SYBRGold-----染色前配制取10000×SYBRGold(n)μl，加入到(10n)ml1×TBE溶液中，装在棕色瓶中避光保存；建议最多重复利用3次，且配置后不宜放置1周以上，以免染色效果不好。10%过硫酸铵（1g溶解于100ml去离子水中）现配1ml左右，保存于-20℃冰箱中，保存时间不宜超过2个月；保存于4℃冰箱中，保存时间不宜超过3周；保存在常温下，只能放置几天。