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动物细胞培养学习（一）前言1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。组织培养中热门的研究领域1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。组织培养的分类及基本概念分类:1.组织培养(TissueCulture)2.细胞培养(CellCulture)3.器官培养（OrganCulture）组织培养的细胞生物学特点:1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。培养细胞的分化细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。不适应（Deadaption）细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。脱分化（Dedifferentiation）由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力培养细胞的分化不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。培养细胞的分化培养细胞的形态1.贴附型：1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等3）游走型细胞：神经胶质细胞4）多形型细胞：神经组织细胞2.悬浮型：如癌细胞培养细胞的生长和增殖1.原代培养（PrimaryCulture）阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cellline）阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。3.衰退阶段：自发性转化（SpontaneousTransformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）:细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinitecellline)或连续细胞系(Continuouscellline)。培养细胞的生长和增殖培养细胞的传代培养当细胞生长达到一定密度后，需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。细胞传代的三个阶段1）潜伏期（Latentphase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长（24~96h）；连续细胞系时间短（10~30min）。2)指数生长期（Logarthmicgrowthphase）：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitoticindex，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。3)停滞期（Stagnatephase）：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。细胞培养的基本条件1)仪器和设备:常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。2)培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。细胞培养的基本条件3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。4)平衡盐溶液:常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。6)其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31；HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。细胞培养的基本条件培养液的物理性质pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚红是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。温度：温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。渗透压：培养液渗透压一般介于260~320mosm/kg之间。人类血浆渗透压290mosm/kg，小鼠类为310mosm/kg。粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。表面张力：培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。培养液的物理性质细胞培养的基本方法1.组织、细胞的解离方法1.1解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。解离时应注意:1)尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；2)剪碎组织时，避免损伤组织块；3)解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。解离细胞常用酶和鳌合剂进行解离：当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物；从单个细胞出发获得细胞群体；从一定量的组织中获得最多的细胞量时。解离细胞的方法1）胰蛋白酶解离细胞法2）胶原酶解离细胞法3）机械解离细胞法4）螯合剂解离细胞法原代细胞培养1）外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。2）单层细胞培养：每隔1~3d换液一次，细胞长成单层后传代培养。3）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长。由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞；通过机械搅动使细胞保持悬浮状态；通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。原代细胞培养培养细胞的污染问题及检测细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。细胞污染的种类和判定1)培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。污染物的检测1.细菌和真菌污染的检测：1）涂片染色镜检；2）接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具。2.支原体检测:支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。污染物的检测支原体检测方法和处理1）荧光技术检测2）直接培养法：实验室常用。3）放射自显影检测4）DNA分子杂交检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。5）污染支原体后的处理：抗生素处理：如加入泰乐菌素等。共培养法：与巨噬细胞共培养。重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4~5周后，重复克隆2次。过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤。支原体检测方法和处理污染病毒的检测1）致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测2）血细胞吸附试验；3）鸡胚接种。细胞间交叉污染为避免细胞间交叉污染，应注意：1.了解各细胞系的特征；2.培养各细胞系的操作手续要快速；3.培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；4.吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内；5.经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。细胞保存1、冷冻速率冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被冷冻到一个能永久保存的温度的一个主要因素。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最佳的冷冻保存效果。不同细胞最适冷冻速率的值也有所不同，所以一种细胞冷冻保存之前要测试出其最适冷冻速度，拟保证获得最高冷冻存活率。细胞保存2、复温速率一般来说复温速度越快越好，37℃水浴中，1～2分钟内要完成复温。3、冷冻保护剂冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，常被加到一定的溶液中进行配制，作为冷冻保护液。红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳类动物细胞悬浮在水或简单的盐溶液中而不加冷冻保护剂，以最适的冷冻速率冷冻保存可获得活的冻存物。对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。细胞保存4、冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低温度。在这样的温度下，细胞生化反应极其缓慢或停止，但经长期保存和复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（﹣196℃）是目前最佳冷冻保存温度。细胞保存