第五章-体内药物分析

药物分析第五章体内药物分析常用体内样品的制备与贮藏1体内样品分析的处理2体内样品分析方法与方法验证3典型体内药物分析应用4熟悉：体内样品的采集与制备方法体内样品分析方法验证的技术要求了解：体内药物分析的性质与意义掌握：体内药物分析的特点和应用体内样品处理体内样品分析方法验证的内容概述体内药物分析生物分析•4方法建立与验证净化与浓集原形、代谢物体液或组织•色谱、免疫分析、生物•完整、部分和交叉验证•原形药物或其代谢物•缀合物、蛋白结合物体内样品存在形式样品制备分析方法•蛋白沉淀、萃取、膜分离•水解、化学衍生化•血液是最常用样品•尿液、唾液、头发和脏器体内药物分析的特点主要来自于体内样品的特点特点1.体内样品的特点（1）采样量少：ml~µl级；且不易重新获得（2）待测物浓度低：µg/ml~ng/ml级，甚至pg/ml（3）干扰物质多：尤其是血样和组织中的蛋白质2.体内药物分析的特点（1）样品需经分离与浓集，或化学衍生化处理（2）对分析方法的灵敏度及选择性要求较高（3）分析工作量大，数据处理和结果阐明繁杂第一节常用体内样品的制备与储存体内样品的种类1体内样品的采集与制备2体内样品的储存与处理3一、体内样品的种类体液组织排泄物血液、唾液脑脊液、胃液、胆汁、乳汁、精液、泪液尿液粪便、汗液胃、肠、肝、肾、肺、脑、肌肉、头发二、体内样品的采集与制备1.血样的采集•静脉，0.2～5ml，≤15%~20%动物总血量2.血浆的制备•抗凝剂，1000g离心5～10分钟，淡黄色上清液3.血清的制备•30分钟～1小时，1000g离心，5～10分钟，上层淡黄色液体4.全血的制备•抗凝剂，不离心血样50%～60％20%～40％常见体内样品1.尿样的特点•原形或代谢物•药物浓度较高•收集量大（1~5L）2.尿样的采集•自然排尿•规定时间段（6～8小时）（时间尿）3.尿样的储存•加入适当防腐剂尿样•TDM（治疗药物监测）测定S（唾液浓度）代替P（血浆游离浓度）进行临床监测1.唾液的组成•腮腺、舌下腺和颌下腺2.唾液的采集•漱口15分钟，安静状态，自然流出的唾液•物理或化学方法刺激3.样品的制备•3000r/min离心10分钟，上清液唾液1.样品的制备•制成水性基质匀浆溶液2.样品的处理（1）沉淀蛋白法（2）酸/碱水解法（3）酶水解法•蛋白水解酶中的枯草菌溶素组织三、体内样品的储存与处理•短期保存：冰箱（4℃）冷藏•长期保存：冷柜（-20℃/-70~-80℃）冷冻，小体积分装1.血浆/血清•分离（2小时），硬质玻璃/聚乙烯管（EP），冷冻2.尿样•冷藏（24~36小时）加防腐剂3.唾液•冷冻保存时，解冻后充分搅匀后再用（一）冷藏与冷冻•采样后立即终止酶的活性•常用方法：液氮速冻，微波照射，匀浆及沉淀，加酶活性阻断剂（氟化钠）或抗氧剂（维生素C），调节pH及样品煮沸（二）去活性酯酶抑制剂，可以有效防止药物在酯酶的作用下发生降解哌唑嗪、敌敌畏噻吩甲酰三氟丙酮二乙异丙嗪5,5′-二硫代双（2-硝基苯甲酸）氟化钠氟化钾敌敌畏•酯酶是普遍存在于全血、血浆和血清中的一类水解酶，能够水解结构中含有酯键的药物羧酸酯酶乙酰胆碱酯酶磷酸二酯酶芳香基酯酶丁酰胆碱酯酶去活性：酶活性阻断剂酯类酰胺类内酰胺类内酯类葡糖苷酸类调节pH有效避免化合物发生降解或者分子内转化•甲酸、醋酸、磷酸、枸橼酸或者缓冲盐溶液去活性：调节pH测定利福平时加入0.5%w/v的维生素C测定左旋多巴及其代谢产物时加入焦亚硫酸钠和乙二胺四乙酸（EDTA）•含有酚羟基结构的药物在生物基质或样品处理过程易发生自身氧化•使用抗氧化剂为常用的方法去活性：抗氧化剂第二节体内样品处理分析方法与样品处理步骤的选择体内样品处理的目的1常用体内样品处理方法2•样品处理（分离、浓集、改性）为药物的测定创造良好条件•样品处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作一、体内样品处理的目的仪器污染，劣化（去蛋白）提高测定灵敏度/选择性化学改性（衍生化）血浆蛋白结合物、缀合物使待测药物/代谢物释放测定药物/代谢物总浓度1.使待测组分游离2.满足测定方法的要求3.改善分析环境样品介质组成复杂：分离待测组分浓度低：浓集样品处理二、常用体内样品处理方法蛋白沉淀法分离与浓集法缀合物水解法（一）（二）（三）化学衍生化法（四）（一）去除蛋白质法•加入与水混溶的有机溶剂，蛋白析出，药物释放•乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃等•血浆/血清与有机溶剂的体积比1∶（2～3）•饱和硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠等•血清与饱和硫酸铵溶液的体积比为1∶21.溶剂沉淀法2.中性盐析法•10%三氯醋酸或6%高氯酸溶液•血清与强酸的体积比1∶0.6•上清液呈强酸性（pH≤4）•酸性下分解的药物不宜用•热变性蛋白质沉淀•通常90℃•方法简单•只能除去热变性蛋白•待测物热稳定性良好3.强酸沉淀法4.热凝固法（二）分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.1.液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的用量水相的pH（1）（2）（3）提取操作（4）（1）溶剂的选取原则1）对药物分子未电离形式可溶，对电离形式不溶；2）沸点低，易挥发；3）与水不相混溶；4）无毒，不易燃烧；5）具有化学稳定和惰性；6）不影响紫外检测1）辅助试剂的使用•乙醚萃取可混入约1.2%水：加入固体氯化钠2）混合溶剂的使用•正己烷-异丙醇（95︰5）溶剂紫外截止波长（nm）沸点（℃）↓极性增加↓正己烷21069环己烷21081甲苯285111异丙醚*22068乙醚*22035乙酸戊酯285149三氯甲烷24561甲基异丁基酮230116乙酸乙酯26077正丁醇215118*：含过氧化物；：肝脏毒性，有致癌作用（2）溶剂的用量•有机相与水相（样品）体积比为1︰1~5︰1•碱性药物pH高于pKa1~2pH单位•酸性药物pH低于pKa1~2pH单位•碱性药物在碱性pH，酸性药物在酸性pH基质中提取；•多在碱性下提取，可减少内源性物质（酸性）的干扰•碱性下不稳定，在中性用三氯甲烷和异丙醇提取（3）水相的pH•一般只提取1次•若提取回收率较低（低于50%），提取2~3次•脂溶性干扰物，可进行小体积水溶液反提取（4）提取操作2.固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法操作步骤注意事项（1）（2）（3）固相萃取法的特点（4）自动化固相萃取（5）（1）固相萃取法的原理•含药物体内样品通过小柱时，受到“吸附”、“分配”、“离子交换”或其他亲和力作用，药物及内源性物质同时被保留在固定相（填料）上•洗脱方式有两种：①药物比干扰物质与固定相之间的亲和力更强：冲洗溶剂洗去干扰物时药物被保留，然后再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物；②干扰物质较药物与固定相之间的亲和力更强：药物直接被洗脱，干扰物被保留（2）固相萃取法操作步骤•第1步：甲醇润湿小柱，活化填料；净化填料•第2步：水/缓冲液冲洗小柱，去除甲醇；甲醇含量过低（低于5%）致C18链弯曲折叠，回收率降低•第3步：加样，使样品通过小柱，并弃去滤过液,平衡,平衡•第4步：水/缓冲液冲洗小柱，去除内源性及其他干扰物质•第5步：洗脱溶剂洗脱待测物，收集洗脱液（3）注意事项1）体液样品（如血浆等）通过萃取柱的流速在1～2ml/min；2）冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当，否则导致药物损失/选择性下降，通常选用可与水混溶的洗脱剂；3）萃取碱性药物时，洗脱剂中常加酸、有机胺、氨水、醋酸铵或离子对试剂（4）固相萃取法的特点当采用亲脂性键合硅胶SPE时•方便、省时•通常可以用小体积的甲醇、乙腈等洗脱剂（200~300μl）完全洗脱药物，净化并浓集样品•不需蒸干即可直接进样（5）自动化固相萃取法•对于单个样品处理，SPE操作省时•对于大量样品的处理半自动SPE：萃取过程机械化全自动化仪器：通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用柱切换：固相萃取-LC/MS/MS（5）自动化固相萃取法3.超滤法•ultrafiltration是一种膜分离技术•按照截留分子量，选择半透膜，可分离30~1000kD的可溶性生物大分子•无化学试剂，无相变化•简便，游离药物分析的首选方法；尤其适合TDM（三）缀合物水解法•简便，快速•水解过程中发生药物分解•专一性较差•葡萄糖醛酸苷酶或（和）硫酸酯酶•专属性强•时间较长•可引入黏蛋白•溶剂萃取过程中缀合物（尤其硫酸酯）直接分解•测定尿药总量、水解缀合物或Ⅱ相代谢产物•趋向于直接测定缀合物1.酸水解法2.酶水解法3.溶剂解法（四）化学衍生化法•药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化，如含有R-COOH、R-OH等官能团的药物GC：①提高药物的挥发性；②增加药物的稳定性；③生成非对映异构体HPLC：①提高检测灵敏度；②改善色谱分离化学衍生化1.在GC中的应用（1）硅烷化：三甲基硅烷（TMCS）（2）酰化：三氟乙酸酐（TFAA）（3）烷基化：碘庚烷（C7H15I）（4）不对称衍生化：（S）-N-三氟乙酰脯氨酰氯（ST-FPC）2.在HPLC中的应用（1）衍生化的分类•柱前/柱后；在线/离线（2）衍生化方法1）紫外衍生化2）荧光衍生化3）质谱检测衍生化4）非对映体衍生化第三节体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立二、分析方法的验证一、分析方法的建立分析方法的选择分析方法建立的一般程序（一）（二）（一）分析方法的选择•HPLC，GC•LC-MS、LC-MS/MS、GC-MS•内源性物质、大多数小分子及部分生物大分子药物的药代动力学•常用的检测方法：色谱分析法、免疫分析法和生物学方法•RIA、EIA、FIA•TDM及生物大分子的药代动力学应用较多•抗生素生物利用度、生物等效性、TDM•微生物学方法一般特异性较差•应用较少，可用于抗生素类药物的分析（二）分析方法建立的一般程序•待测物、内标（必要时）的对照标准物•色谱柱（填料）、流动相、流速、进样量•分析方法的建立和验证过程系同步进行•为便于讨论，以色谱分析法为例分别叙述1.色谱条件的筛选•试剂与溶剂试验•生物基质试验•质控样品试验•代谢产物对待测物、内标物的干扰•配伍用药的干扰2.色谱条件的优化3.试验样品的测试二、分析方法的验证选择性标准曲线与定量范围定量下限（一）（二）（三）精密度与准确度（四）样品稳定性（五）提取回收率（六）基质效应（七）试验样品分析试验样品浓度超出定量范围的处理作为外源性药物使用的内源性物质的测定（八）（九）（十）微生物/免疫学方法的验证（十一）名词解释（十二）（一）选择性•比较待测物的对照标准物质与6个不同个体的空白生物基质和QC样品•软电离质谱（LC-MS或LC-MS/MS）基质效应•比较QC样品和至少6个不同个体用药后的试验样品•必要时HPLC-DAD和LC-MS确证峰的单一/同一性•选择性（selectivity），体内样品所含其他物质不得干扰对样品的测定或者其干扰在分析方法的可接受范围内。1.内源性物质2.未知代谢物•比较待测药物、同服药物、待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品3.同服药物4.参比方法•参比方法横坐标（x），拟定方法纵坐标（y），最小二乘y=a+bx•a表示受到恒定干扰的程度•b表示受到比例干扰的程度（如，标记抗原不纯，交叉免疫）（二）标准曲线与定量范围•少数方法（如，IA）外，通常为线性模式•线性回归：最小二乘法或加权最小二乘法•自变量（x）为药物浓度，因变量（y）为分析物与内标的响应信号强度比值；定量范围由分析物的定量下限和上限决定。1.标准曲线的建立（二）（1）工作溶液：n≥6（不包括0点）；通常为100~1000倍（2）内标溶液（3）系列校正标样：空白生物基质，加入工作溶液（4）标准曲线的绘制：药物浓度，以单位体积（如血浆）或质量（如肝脏）的生物基质中加入分析物对照标准物质的量表示2.限度要求•通常用至少6个浓度建立标准曲线非线性相关（如IA）可能需要更多浓度点•定量范围覆盖全部待测样品浓度范围定量上限（ULOQ）应高于用药后的峰浓度（Cmax）定量下限（LLOQ）应低于Cmax的10%~5%（1/10~1/20）•标准曲线各浓度点的回归计算值（x′）与