质粒DNA电泳的三条带

质粒DNA电泳的三条带质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：1、培养细菌使质粒扩增2、收集和裂解细菌3、分离和纯化质粒DNA碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时，质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。(a)道中的SCDNA走在最前沿，OCDNA则位于凝胶的最后边；(b)道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OCDNA和SCDNA之间三、材料、试剂及器具1、材料E.coliDH5α（pUC19vector）2、试剂1)LB培养基2)TE缓冲液3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ4)酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）5)无水乙醇6)70%乙醇7)氨苄青霉素50mg/mL器具离心机、离心管、吸嘴四、操作步骤以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄青霉素（Amp）100μg/ml)的LB培养基中37℃振摇过夜（12-18h）↓取1.5ml培养物置离心管中↓10000rpm,离心1min，或4000rpm，离心5-10min↓去上清，倒扣干净吸收纸上吸干↓沉淀+100μL溶液Ⅰ↓加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置10min↓+加200μL溶液Ⅱ（新鲜配置）↓温和颠倒数次，混匀，冰上放置5min↓+150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀，冰上放置15min↓离心12000rpm,15min↓上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，12000rpm,离心5min↓小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质↓上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min↓12000rpm,5min-15min↓弃上清沉淀+1mL70%乙醇↓12000rpm离心5min-15min↓弃上清；并倒扣离心管使液体流干↓+自然干燥或真空抽干（看不到液滴为宜）↓加50μlTE缓冲液（20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗取物↓-20℃保存六、实验报告检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。七、思考题分析以下试剂的作用原理：溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖5mmol/LtrisHCL(Ph8.0)10mmol/LEDTA(PH8.0)溶液Ⅱ:0.4mol/LNaOH2%SDS使用前新鲜配制溶液Ⅲ：5mol/LKac60mL冰醋酸11.5mL水28.5mLRNaseA酶：将粉末溶于10mmol/LtrisHCL(Ph7.5)、15mmol/LNACL中，配成10mg/mL浓度的酶液，于100℃水浴加热15min，缓慢冷却至室温，-20℃保存氯仿无水乙醇