crisper-cas9技术简介

基因组编辑技术-CRISPR/Cas9杨兴林博士主要内容1.CRISPR/Cas9技术的基本原理2.CRISPR/Cas9主要实验流程3.和元公司CRISPR/Cas9系统介绍CRISPR/Cas9技术的基本原理一种利用同源重组(HomologousRecombination,HR)或者非同源末端连接(Non-homologousEndJoining,NHEJ)原理改变生物体内源基因的遗传学技术。这一技术可以用于删除某一基因、去除外显子或导入点突变，从而可以对此基因的功能进行研究。基因组编辑技术HR&NHEJ靶向基因操作技术的发展同源重组载体–几率低(~1HReventper105-106cells）主要应用在动物水平很难进行细胞水平的基因操作同源重组载体DSB(double-strandbreaks)的引入同源同组效率提高1-2个数量级（10-100倍）引入靶向的双链断裂(DSB)蛋白/复合体要满足的基本条件：1.能入核2.能识别指定的DNA序列并与之结合3.具有非序列特异的核酸酶活性•归巢核酸内切酶(meganucleases)每个DNA结合域单位识别12-40个连续的碱基•锌指核酸酶(zincfingernucleases,ZFNs)6aa可特异识别3连碱基•TALEN(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease)•CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins)CRISPR/CAS9系统Cas9系统原理示意图GN19NGGCRISPR/CAS9系统目前的问题三种基因组编辑技术设计方案的比较二聚体活性延续ZFN设计思路mutantCas9CRISPR/Cas9主要实验流程靶基因分析-第一外显子-第一内含子-第二外显子Cas9位点查找选择最优的cas9靶点Cas9位点查找Cas9载体构建Cel1实验原理示意图Cas9载体活性验证Cas9质粒活性检测实例PCR产物~500bp预测切割产物~340bp预测切割产物~160bpControlCas9和元公司CRISPR/Cas9系统介绍•基于慢病毒载体的Cas9系统•基于腺病毒载体的Cas9系统•基于腺相关病毒载体的Cas9系统和元Cas9载体系统几种常见病毒系统比较载体大小载体全名编号说明9.0kbpAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9H210单一载体含gRNA和Cas99.0kbpAdeno-U6-sgRNA-CMV-3Flag-hCas9nH214单一载体含gRNA和Cas9n5.5kbpAdeno-U6-gRNA-CMV-EGFPH217腺病毒,gRNA载体9.1kbpAdeno-CMV-mCherry-T2A-3Flag-hCas9H218腺病毒,红色荧光标记9.1kbpAdeno-CMV-mCherry-T2A-3Flag-hCas9nH219腺病毒,Cas9n红色荧光标记基于腺病毒载体的Cas9系统基于慢病毒载体的Cas9系统载体大小载体全名编号说明11.9kbpLenti-CMV-Puro-T2A-3Flag-Cas9H136Puro抗性标记11.9kbpLenti-CMV-Puro-T2A-3Flag-Cas9nH137Cas9n,Puro抗性标记7.9kbpLenti-U6-gRNA-CMV-EGFPH140慢病毒,gRNA载体基于腺相关病毒载体的Cas9系统载体大小载体全名编号说明7.4kbpAAV-miCMV-Cas9H422腺相关病毒,Cas96.2kbpAAV-U6-gRNA-CMV-EGFPH423腺相关病毒,表达gRNAThanks!更多内容欢迎访问我们公司网站:联系方式:杨兴林,[e-mail]