激光共聚焦扫描显微镜原理功能

--基本原理及实例应用闫建设研究员2014-10-282014级硕士研究生细胞生物学技术1990-1994，学士，河南师范大学1994-1997，硕士，中国科学院动物研究所2000-2005，博士，以色列魏茨曼科学研究院(WeizmannInstituteofScience,Israel)2005-2006，博士后，加利福尼亚大学圣迭戈分校(UniversityofCalifornia,SanDiego)2006-2012，ResearchFellow,美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所(NIH/NIAID)2012-至今，研究员、PI，上海交通大学医学院上海市免疫学研究所教育及研究经历它和荧光显微镜的关系？它和电子显微镜的关系？观察的信号如何而来？第一部分--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。泛指将微小(分辨率0.2μM)不可见或难见物品之影像放大,而能被观察的工具。目镜光源聚焦旋钮光阑和聚光器载物台物镜显微镜（Microscope）用于研究荧光或荧光标记物质的光学显微镜。照相装置分光镜光源（汞灯）标记了荧光的样品基本原理紫外、蓝、绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光物镜标本针孔（pinhole）焦平面荧光显微镜光源针孔检测针孔激光共聚焦扫描显微镜分光镜光源检测器标本物镜荧光显微镜系统样品激光共聚焦扫描系统断层扫描技术，逐点逐行扫描成像CCD成像技术，一次性成像X光机CT机普通荧光显微镜激光共聚焦显微镜特点：侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。特点：侧面有扫描器接口；装有微量步进马达；装有防振动装置；装有光路转换装置；配高数值孔径的物镜。•荧光显微镜光源•汞灯•卤素灯•其他普通光源特点•激发波长范围广•激光共聚焦显微镜光源•激光特点•光色纯•方向性好•能量可调--以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。优势高垂直分辨率，使光学切片，三维重建成为可能高水平分辨率•人眼分辨率：0.20mm•光学显微镜分辨率：0.25mm•共焦显微镜分辨率：0.18mm•电子显微镜分辨率：0.20nm局限共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是0.15mm，轴向分辨率0.5mm。观测厚度（60X）：50-100mm共聚焦显微镜是逐点成像，成像速度较慢1957年，MarvinMinsky在他的专利中首次阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的基本工作原理1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面1970年，Sheppard和Wilson推出第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像，至此LSCM技术基本成熟1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜目前常见的激光共聚焦显微镜扫描器系统荧光显微镜系统计算机图像存储与处理系统ZeissLSM-710ConfocalSystem激光光源LeicaTCSSP8ConfocalSystem第二部分ZOOM成像薄层光学切片荧光定量分析多维度成像多通道同时扫描激光共聚焦显微镜的功能使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰。使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。牛肺上皮细胞展现最清晰成像细节ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon展现最清晰成像细节检测人类癌细胞表皮生长因子高清晰成像小鼠神经元细胞高清晰成像普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。激光共聚焦显微镜的功能绿色：SYBR14染色，活精子红色：PI染色，死精子绿色：活菌红色：死菌牛精子藤黄微球菌拟南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia斑马鱼神经元系统，byAlbertPan，HarvardUniversity视网膜烟花，byJoshR.Sanes,HarvardUniversity激光共聚焦显微镜的功能在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。通过调节针孔的大小，控制样品扫描层面的厚度，可逐层获得高分辨率的光学横断面图像。并可用计算机软件后期合成去除非交信息的三维立体图像。XYZ扫描XYT扫描激光共聚焦显微镜的功能胚胎的结构单层面扫描多层叠加切片分层叠加三维图像重建三维图像重建细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。激光共聚焦显微镜的功能随机圈取细胞，可得到所圈细胞的相对荧光强度值利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的水平差异。第三部分荧光：物质吸收能量后所释放出的冷发光现象通常为吸收短波长的能量后发散出长波长的光荧光光谱：激发光谱—通过测量荧光物质的荧光发射强度随激发波长变化而获得的光谱。发射光谱—荧光物质的荧光发射强度随放射波长变化而获得的光谱。488nm525nmFITC450nm490nm400450500550600650700750800EXCITATIONandEMISSIONSPECTRA激发光谱发射光谱TexasRedCy5INTENSITY[arb.units]WAVELENGTH[nm]FITCRhodamine荧光物质不同其光谱也不同自发荧光：指组织细胞不经任何荧光染色便能够激发荧光。免疫荧光：荧光抗体法产生荧光。外源导入荧光蛋白：利用转基因技术将荧光蛋白基因导入细胞里，让其表达融合蛋白而产生的荧光。组织和细胞中荧光的来源荧光染色：很多荧光染料与组织细胞作用，能够在光的作用发出特征波长的荧光，借以观察组织细胞的形态结构、化学组成和功能。由于长波能量低,细胞忍受能力强,适合活体检测。荧光极其稳定,适合长时间观察。分子量较小,易与目的基因形成融合蛋白，不影响目的蛋白的空间构象和功能。238个氨基酸组成。吸收峰479nm发射波长508nm衍生物和突变体：BFP、CFP、GFP、RFP、YFP1962年首次水母中分离绿色荧光蛋白展示了绿色荧光蛋白作为各种生物现象的亮光基因标签的价值将颜色标签扩展至除绿色之外的颜色，以便可以用各种颜色标识不同的蛋白和细胞。下村修马丁沙尔菲钱永健2008年度诺贝尔化学奖“做出应获诺贝尔奖工作的科学家，几十年默默无闻；被广泛应用的分子，很少人知其发现者；原始论文鲜为人知，后继论文倒很热门；曾失明的人，发现了美丽的发光蛋白……”━饶毅“我想知道，今年到底是哪个笨蛋获奖……我打开笔记本电脑，发现我就是那个蠢货”普拉舍1992年发表GFP基因文章后，缺少经费，离开科学界。GFP诺奖得主的人生际遇荧光探针与荧光标记：采用一定的标记物，使样品中待测物质具有特定的荧光特征，这种标记物被称为荧光探针。这种给样品赋予特征荧光的操作称作荧光标记。荧光探针的种类：①大分子探针②细胞器探针③核酸探针④金属离子探针⑤细胞电位和细胞内pH值探针⑥分子的特殊集团结合探针……选择的依据：根据实验目的确定需要检定的指标；确定可供选择的荧光探针的范围；考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求；考察荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况。标记的荧光需要在不被其他因素的干扰下能被激光共聚焦显微镜系统检测到原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。标记要求荧光素选择/组合核复染单标无特殊限制。FITC,Cy2最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红外)与自发荧光冲突时，采用TexasRed。PI/DAPI双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必须顺序扫描)DAPI(必须顺序扫描)三标FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5(必须顺序扫描)活细胞追踪能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间存在、随细胞分裂进入子细胞()显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）1.作为亚细胞定位的标记蛋白定位在哪里呢？2.作为整体结构的标记图中共有多少个细胞？阳性蛋白的表达效率是多少？原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。标记要求荧光素选择/组合核复染单标无特殊限制。FITC,Cy2最佳；尽量不选择Cy5,Cy5.5（红外)与自发荧光冲突时，采用TexasRed。PI/DAPI双标FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必须顺序扫描)DAPI(必须顺序扫描)三标FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5(必须顺序扫描)活细胞追踪能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间存在、随细胞分裂进入子细胞()显微注射；转基因技术（GFP；GFP-ACTIN）样品前处理组织切片：切片的厚度4-50mm①冰冻切片：优点是易操作，荧光背景低；缺点是容易破坏组织结构，不利于形态观察。②石蜡切片：优点是样品易保存，缺点是容易引入干扰荧光。细胞标本：①细胞种类和纯度杂细胞的干扰会导致错误实验结果。②细胞密度：如果进行形态观察、三维重建、定位荧光信号，细胞密度不低于20％；如果是测定荧光强度，细胞约占视野面积的80％。③承载细胞的器皿：petri皿（又称小皿）：适用面最广，可用于活的或固定的细胞样品。盖玻片：适用于固定的细胞。样品前处理---荧光标记---上机观察样品前处理---荧光标记---上机观察荧光标记染料直接染色：生物样品与荧光探针直接作用，使样品具有荧光。免疫荧光：是将抗体标记上荧光素与细胞或组织内相应的抗原结合后，通过观察检测特征的荧光，定性、定位及定量的检测样品中的抗体。表达荧光蛋白：跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白定位的标记物。免疫荧光直接标记：一抗上带有荧光探针间接标记：二抗上带有荧光探针上机观察前的注意事项：尽快上机采集图像，防止荧光泄漏、荧光淬灭及细胞干燥等导致的荧光变化。封片：△防止样本变形△防止荧光褪色△用于LSCM的盖玻片厚度应为0.17mm在用激光共聚焦显微镜观察前，先用普通荧光显微镜观察有无信号。样品前处理---荧光标记---上机观察样品的阴性对照：病变组与非病变组药物处理的阴性对照：加药组与未加药组荧光染色剂的阴性对照：未加一抗的荧光二抗组与未加荧光染料组设立阴性对照设立阴性对照1.简述激光共聚焦显微镜的工作原理。2.简述激光共焦显微镜与荧光显微镜的差别。它有哪些优缺点？3.简述激光共聚焦显微镜的功能。