PCR技术在食品科学领域中的应用

食品生物技术导论——PCR技术在食品科学领域中的应用学院：食品学院班级：食工09级一班学生：蒋璐璐学号：2009113167指导老师：刘福林PCR技术在食品科学领域中的应用摘要：本文综述了PCR的技术原理，PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常。PCR技术的发展历程及其在食品微生物检测、转基因食品、食品成分检测等方面的应用并对PCR技术今后的发展作出展望。关键词：PCR技术原理食品应用引言：PCR(PolymeraseChainReaction)即聚合酶链式反应，又称多聚酶链反应、基因的体外扩增法、无细胞克隆技术等。这是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法。利用此方法,能使极其微量的目的基因或某一特定的DNA片段在几小时后迅速扩增数百万倍,且无需通过繁琐费时的基因克隆程序,便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。1983年，PCR技术由美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明，因其特异性强,灵敏度高、快速和准确等优点，在食品、农业、医药、分子生物学等领域得以广泛的应用。本文主要对PCR技术在食品科学领域中的应用进行综述。1、PCR技术的基本原理PCR技术由三个步骤反复的热循环构成:高温变性、低温退火和适温延伸。高温变性，在高温(95℃)条件下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；低温退火，在低温(37～55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链；适温延伸，即在特异耐热酶-TaqDNA聚合酶的最适温度(72℃)时,引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成新的DNA链[1]。新合成的DNA双链又可作为扩增模板，反复进行解链、退火、延伸三个步骤的热循环，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增,经过25～30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上可达106～107倍。基于PCR技术的基本原理，多种新的应用模式应运而生，使PCR技术得到进一步的完善，出现了实时PCR(Real-timePCR)、原位PCR(InsitePCR)、反转录PCR(ReversetranscriptPCR,RT-PCR)、标记PCR(LabelledPrimersPCR,LP-PCR)、彩色PCR(ColorComplementationAssayPCR,CCAPCR)、反向PCR(ReversePCR)、不对称PCR(AsymmetricPCR)、重组PCR(RecombinantPCR)免疫PCR(Immuno-PCR)、多重PCR(MultiplexPCR)、膜PCR(membrane-boundPCR)等。这些新的技术使PCR技术具有更广的应用潜力。1.1PCR的要素基本的PCR须具备：1.要被复制的DNA模板(Template)2.界定复制范围两端的引物(Primers).3.DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料及水。PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1).Denaturation2).Annealingofprimers,and3).Extensionofprimers。所谓Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板.而Annealing则是令Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。最后在DNA聚合酶(e.g.Taq-polymerase)的作用下进行引物的延长(Extensionofprimers)及另一股的合成。2、PCR技术的发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。1985年，美国科学家KaryMullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，KaryMullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。而后，Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。2.1PCR的运用PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常(Genemutation,deletion,andrearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估；对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取(DNAsequencing)及其它的运用。举凡对生物标本及法医学上的样本鉴定，从单一毛发、一只精虫或一滴血液、唾液来找出凶手。也可以做DNA指纹(Fingerprints)比对帮助亲子关系的鉴定。PCR更可以用于器官移植组织兼容性HLA的分析。另外在演化上的分析，经由PCR的运用也产生重大的进展。近来，在生物医学的研究上，特别是细胞间讯息的传递分子，诸如介白质(Interleukines)及各种生长因子(Growthfactors)基因的表现都可用PCR来进行质与量的分析。3、PCR技术在食品科学领域中的应用PCR技术最早应用于基因克隆和转基因检测,但由于其精确、微量的特点,已经广泛应用到其他领域。特别是在食品科学领域足见显示出其应用前景。PCR技术主要应用于食品微生物的检测、转基因食品的检测、食品成分及产地的检测等。3.1PCR技术在食品微生物检测方面的应用食品在生产、运输、销售过程中易受到微生物的污染,所以微生物检验是食品检验中的一项重要内容。目前常规方法(尤其是对致病菌的检验)操作繁琐,耗时长。随着PCR技术的发展,人们尝试利用该技术来进行微生物检验,取得了较好的效果。3.1.1沙门氏菌沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，不耐热，可感染人和动物，极易引起人类的食物中毒。乳、蛋、家禽和肉类产品是其主要传播媒介。由于沙门氏菌的含量水平在污染食品中较低，加上食品本身性质的干扰和食品加工过程的影响,使得检测沙门氏菌相对困难。传统方法一般需要4～7d才能完成。PCR技术以其敏感性强、特异性高、简便、快速等优点,已广泛应用于沙门氏菌的检测。1993年，Song[2]等人利用PCR技术成功的检测到血液中的伤寒沙门氏菌DNA。1997年，沈孝民[3]等，用PCR技术对各种不同血清型的沙门菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物进行了检测，结果显示该方法特异性高，且灵敏、快速，可检出0.05pg水平的DNA，并可在1d之内完成。2008年，钟伟军[4]等，将荧光定量PCR应用于快速检测鲜猪肉和鲜鸡蛋等食品中的沙门氏菌含量的检测，实验在12h内完成。3.1.2单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌是革兰氏阳性菌，耐碱不耐酸，在低温下仍能生长。是李斯特菌属中引起食物中毒的菌种，它能致病和产生毒素，其毒素具有溶血性质。任何来源于动物和植物的新鲜食品都可以含有不同的单核细胞增生李斯特菌。过去对食品中单核细胞增生李斯特菌进行检测时，克隆培养的标准方法需要3～4周才能得出结果；血清学检测方法(如ELISA等)也存在着特异性、敏感性差等问题。姜永强[5]等，根据发表的单核细胞增生性李斯特菌的重要毒力基因hlyA的全基因序列，设计出引物，建立了该菌的PCR诊断方法。孙焕冬[6]等通过半套式PCR的方法检测模拟阳性牛奶的致病菌,在有10个活菌存在时即可扩增出特异性产物,灵敏度比常规PCR提高了10倍,建立起了一套快速检测食物中李斯特菌的方法。巢国祥[7]等通过扩增hly基因PCR法建立快速检测单核细胞增生李斯特菌方法检测模拟污染生猪肉、水和牛奶,检测限达10cfu/5g(mL)。3.1.3金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌,革兰氏阳性兼性厌氧菌，能耐受较低水分活性。对热、高糖有一定的耐受能力。金黄色葡萄球菌能在食物内增殖并产生的体外毒素—肠毒素，葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒的主要原因。由本菌产生的食物中毒发生频率高,因此对食品和食品制造环境中的金黄色葡萄球菌进行鉴定是食品卫生检验的重要内容。该菌主要通过污染食品如肉色拉和奶制品等,引发食物中毒的，对于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测,以往主要用免疫学方法检测,但常出现假阳性或假阴性的结果,因为有些菌株检测分析虽然含有毒素基因,但基因表达不好,或是缺乏稳定的遗传成分,这就容易出现假阴性；有些菌株的血清型容易产生交叉反应,因而又常常出现假阳性。Johenson[2]等建立了检测葡萄球菌肠毒素毒素基因的PCR技术，可在较短的时间内检测出葡萄球菌毒株，并且具有极高的特异性、敏感性。Scherrer[8]等分别从罐装牛奶,羊肉当中用PCR的方法检测出了金黄色葡萄球菌的存在。3.1.4大肠杆菌大肠埃希菌，俗称大肠杆菌，为革兰氏阴性杆菌。致病性大肠杆菌主要有肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌。肠出血性大肠杆菌已经成为世界性的重要的公共卫生和食品安全问题,曾在日本、美国、加拿大等国造成了暴发流行和大规模食物中毒事件。大肠杆菌O157:H7可引起出血性腹泻,严重的可引起溶血性尿毒综合症、血栓形成性血小板减小性紫癜,其中并发两病者死亡率高达80%左右,危害十分严重。薄清如[9]等建立了五重和四重PCR方法,同时检测大肠杆菌O157:H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因,可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157:H7,并有较高的特异性,解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低,并有交叉反应等问题。张险朋[10]等尝试应用荧光PCR方法检测冻肉产品中的0157:H7,结果与生化鉴定检测一致,而且从增菌到出结果可以在10h内完成,而且操作简便,在检测过程中可以进行实时监控,比传统的细菌分离和生化鉴定节约了起码62h。杨小鹃[11]等对大肠杆菌O157:H7进行特异性检测的多重PCR技术,可在9～10h内完成,与传统检测方法相比,该多重PCR方法省时、省力、高效。3.1.5黄曲霉毒素黄曲霉毒素是由黄曲霉、寄生曲霉、模式曲霉这一类真菌产生的毒素。可引起动物急性中毒死亡与致癌，是致癌力最强的毒素。由黄曲霉毒素污染食品及油料作物引起对人的危害的报道很多，是国内外科学界研究的热点。传统检测采用鉴别培养基或免疫学方法，样品需纯化，费时又费力；PCR技术能检出混杂样品中的微量黄曲霉毒素DNA片段。秦文彦[12]等，建立了快速灵敏检测食品和饲料中产黄曲霉毒素真菌的多重PCR体系。3.1.6其他致病菌蔡亦红[13]以福氏志贺菌侵袭性质粒抗原H基因研究对象建立一种稳定的、高敏感性和特异性的PCR体系,力图快速、准确检测食品中志贺菌感染。罗兆飞[14]等，根据奇异变形杆菌抗亚碲酸盐基因的保守序列设计Q248F/R,确定PCR条件,利用标准菌株检验方法的特异性和敏感度。引物Q