环境DNA在水域生态的应用

前言水生生物是全球生物多样性的重要组成部分，是近年来生物多样性保护的重点对象。相对于陆生动物，水生生物特殊的生存环境、生活习性及相对滞后的资源调查方法，使得众多水生物种缺少基础的生物学信息，如种群分布区、种群组成和种群动态等，这些信息的缺乏阻碍了水生生物保护生物学研究的开展，亟需一种新的资源监测方法改变这一现状。01环境DNA简介02环境DNA的实验流程030405濒危物种调查中的应用环境DNA的不足与展望入侵物种调查中的应用目录CONTENT环境DNA简介01环境DNA简介环境DNA是指生物与环境互作遗留的DNA，可能来源有生物脱落的组织、分泌物、排泄物、血液和尸体等，分布在土壤、沉积物、冰芯和自然水体等环境中，是生物完整和片段化DNA的混合物。环境DNA环境DNA技术是指从环境样品(土壤、沉积物和水体等)中直接提取DNA片段后利用测序技术进行定性或定量分析的方法环境DNA技术环境DNA发展历史BDACTheAmericanBullfrog(Lithobatescatesbeianus)wassuccessfullyidentified,showingthatearlydetectionofinvasivespeciesatlowdensitiesispossibleandhasimplicationsformanagementFreshwaterEnvironmentalDNAasamethodtoassessthediversityofmacro-organismalcommunitieswasfirstappliedtosedimentsrevealingDNAfromextinctandextantmammals,birdsandplants,followedbydrycavesediments,Later,itwasshownthatalsoDNAfrominvertebratessuchasinsects,aswellasfungisedimentsMetabarcodingofeDNAfromsurfacesoilhasthusefficientlybeenusedasaproxyforplanttaxonomicdiversityinseveraldifferentterrestrialecosystemssoil‘‘EnvironmentalDNA’’arosewiththeideaofobtainingnucleicacidsofmicrobesdirectlyfromenvironmentalsamplesmicrobial环境DNA的实验流程02环境DNA的实验流程样品的现场采集01结果分析04DNA扩增与测序0302样品的保存与DNA的提取直接采集水样或者现场过滤，样品的体积一般为2L，采样点尽量覆盖目标区域，每个样点重复三次水样保存在-4摄氏度，24h内提取，滤膜保存在-20摄氏度，针对不同的研究对象应该采取不同的提取方法，以达到最佳的提取效果。利用引物进行PCR，可以判断出样品中是否包含目标水生生物的DNA识别片段，再进行测序便可得到该片段的序列。测序后，用BLAST可将所得序列与GenBank所储存的序列进行比对，BLAST可依据与该序列的相似度给出一系列DNA序列以及它们的物种信息。样品的现场采集01在收集水样时直接对其进行过滤，如利用蠕动泵抽取水样时，将过滤设备连接在管线中，记录水样体积后，只需将滤膜保存带回即可。（也可使用filter手动过滤）现场过滤02一种是先利用蠕动泵、采样器等采样工具进行水样收集，再单独进行过滤，2步分开进行，但都在野外；第二种是水样采集-保存-实验室过滤则是完成水样收集后，采取适当的措施将水样保存，带回实验室后再进行过滤，研究表明野外过滤的效果最好采样后过滤滤膜孔径一般选取在0.45um左右，水样采集的体积从15ml-5L不等，一般来说都是采集1-2L,从同一水域多次采集得到，一般每个样品做3-10个平行样，尽量覆盖采集区域以增加检测到目标物种的概率。样品的保存与DNA的提取现场过滤是将所得滤膜直接存储在－20℃冰箱。水样的保存一般是加3mol·L-1乙酸及无水乙醇，而且水样采集后应该尽快提取DNA，最长不超过24h。在运输时应该避光低温保存，一般4摄氏度，避免水样出现冰冻融化过程造成DNA降解。不过滤的水样可以使用化学沉淀法，使用2.5倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇使水样里的DNA沉淀，然后离心提取DNA，还可以通过氯仿、细胞物理裂解、二氧化硅和DNA快速试剂盒等方法提取水样中的DNADNA扩增与测序结果分析鱼类研究案例环境DNA优点pros04030201IndependenceofweatherconditionSensitivity+Cost-effectivenessNon-invasivenessStandardization环境DNA研究现状入侵物种调查中的应用03入侵物种调查中的应用Asiancarpssilvercarp(Hypophthalmichthysmolitrix)andbigheadcarp(H.nobilis)入侵物种调查中的应用CrayfishProcambarusclarkii濒危物种调查中的应用04濒危物种调查中的应用国王鲑（Oncorhynchustshawytscha）西北太平洋的标志性物种帝王鲑（Oncorhynchustshawytscha）在过去的7000多年里已经失去了2／3的遗传多样性。未来鲑鱼种群会受到栖息地减少、过度捕捞、水坝以及孵化场数百万鱼苗投放带来的伤害，就在鱼群已经在努力去适应气候变化和海水酸化的时候。濒危物种调查中的应用洞螈（Proteusanguinus）环境DNA不足的展望05环境DNA的未来研究方向ThetemporalandspatialdistributionofeDNAindifferenthabitats,whichgivesinformationastowhatpartofthebiodiversityismonitoredinspaceandtime.01TheexactsourcesofeDNA,whetherthiscomesfromsloughedepithelialcells,intestinalcells,faecesandurine,etc.,whichmightvarywithlifestagesofthetargetorganismandcouldthereforegreatlyinfluenceabundanceestimates.03MorepreciselinksbetweeneDNAconcentrationandspeciesabundancewhetherthisismeasuredastotalbiomassordensityofindividuals.02Physio-chemicalfactorsinfluencingeDNAavailabilityanddegradationsuchastemperature,pHandsalinity.04eDNA的展望左图是Biomemetwo3,可以和iPhoneSE组成Real-timePCR下图是MinION,MinION会让DNA长链穿过被称为纳米孔的小孔，并且探测由DNA的4个核苷酸组件引发的电流微小变化，从而阅读序列信息。Reference[1].Rees,H.C.,etal.,REVIEW:ThedetectionofaquaticanimalspeciesusingenvironmentalDNA-areviewofeDNAasasurveytoolinecology.JournalofAppliedEcology,2014.51(5):p.1450-1459.[2].Jerde,C.L.M.A.,“Sight-unseen”detectionofrareaquaticspeciesusingenvironmentalDNA.ConservationLetters,2011.4(2):p.150-157.[3].TABERLET,P.,etal.,EnvironmentalDNA.MolecularEcology,2012.21(8):p.1789-1793.[4].Bohmann,K.,etal.,EnvironmentalDNAforwildlifebiologyandbiodiversitymonitoring.TrendsinEcology&Evolution,2014.29(6):p.358-367.[5].Wilcox,T.,etal.,RobustDetectionofRareSpeciesUsingEnvironmentalDNA:TheImportanceofPrimerSpecificity.PLoSOne,2013.8(3).[6].刘军等,鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证.淡水渔业,2016(01):第9-17页.[7].马鸿娟,S.K.马.任.,环境DNA及其在水生生态系统保护中的应用.生态学杂志,2016.2(35):第516-523页.[8].郝雅宾等,环境DNA技术在鱼类资源研究中的应用.生物技术通报,2018:第1-7页.[9].Evans,N.T.andG.A.Lamberti,FreshwaterfisheriesassessmentusingenvironmentalDNA:Aprimeronthemethod,itspotential,andshortcomingsasaconservationtool.FisheriesResearch,2018.197:p.60-66.[10].张红星等,环境DNA分析技术-一种水生生物调查新方法.水生态学杂志,2016.5(37):第1-7页.[11].Turner,C.R.,etal.,ParticlesizedistributionandoptimalcaptureofaqueousmacrobialeDNA.MethodsinEcologyandEvolution,2014.5(7):p.676-684.[12].TABERLET,P.C.E.H.,EnvironmentalDNA.MolecularEcology,2012.21(8):p.1789-1793.[13].Carraro,L.,etal.,EstimatingspeciesdistributionandabundanceinrivernetworksusingenvironmentalDNA.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2018.115(46):p.11724-11729.[14].Pilliod,D.S.,etal.,EstimatingoccupancyandabundanceofstreamamphibiansusingenvironmentalDNAfromfilteredwatersamples.CanadianJournalofFisheriesandAquaticSciences,2013.70(8):p.1123-1130.[15].Takahara,T.,etal.,EstimationofFishBiomassUsingEnvironmentalDNA.PLoSOne,2012.7(4):p.e35868.[16].Ficetola,G.F.,etal.,SpeciesdetectionusingenvironmentalDNAfromwatersamples.BiologyLetters,2008.4(4):p.423-425.[17].Dejean,T.,etal.,ImproveddetectionofanalieninvasivespeciesthroughenvironmentalDNAbarcoding:theexampl