质谱

质谱在多肽分析中的应用Confidential朱明月2013.12.18目录Confidential1.质谱的相关知识1.1质谱法的定义1.2质谱法的特点1.3质谱法中常用的术语1.4质谱能够提供的信息2.质谱仪的工作原理2.1工作原理2.2基本结构3.液质联用的使用方法LCMS3.1液质联用的分析方法3.2液质联用的合适流动相4.一般质谱解析4.1质谱图4.2一般软电离离子源质谱图解析1.质谱的相关知识质谱法是通过将样品转化为运动的气态离子并按质荷比（m/z）大小进行分离记录的分析方法。所获得结果即为质谱图（亦称质谱）。根据质谱图提供的信息可以进行多种有机物及无机物的定性和定量分析、复杂化合物的结构分析、样品中各种同位素比的测定及固体表面的结构和组成分析等。质谱仪早期主要用于原子量的测定和定量测定某些复杂碳氢混合物中的各组分等。1960年以后，才开始用于复杂化合物的鉴定和结构分析。实验证明，质谱法是研究有机化合物结构的有力工具。1.1质谱法的定义•质谱仪器较为精密，价格较贵，工作环境要求较高，给普及带来一定的限制。4S特性：Sensitivity灵敏Speed快速Specificity特异Stoichiometry化学计量1.2.质谱法的特点（1）质荷比(m/z)质谱图中的横坐标，质量与电荷之比。若离子所带电荷为z=1，则质荷比等于该离子的质量数。（2）离子的强度（丰度）I：两种表示方法百分强度：所有峰的强度之和为100，每个离子所占的份额即为其百分强度，百分强度=(Ii/Ii)×100%Ii，第i个离子的强度。基峰强度：质谱图中离子强度最大的峰称为基峰，定义它的强度为100，即IB=100，其它离子强与之相比的百分强度称为该离子的强度。（3）同位素化学上，氖的原子量为20.2,质谱上：氖不在m/z20.2处出峰，而是在m/z20和m/z22处各出一个峰，该峰的相对强度为10:1。1.3.质谱法中常用的术语（4）质谱中的离子分子离子：样品失去或得到一个电子得到的，代表完整的样品分子，是所有其它碎片离子的前提。碎片离子：广义上指除分子离子以外的所有离子。重排离子：经过重排，断裂一个以上化学键所生成的离子。母离子与子离子：任何一个离子进一步裂解为质荷比较小的离子，前者是后者的母离子或前体离子，后者是前者的子离子。⑴相对分子质量低分辨质谱就可以确定相对分子质量，高分辨质谱可精确到0.0001；⑵分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量,均可以确定分子式；⑶鉴定某些官能团如甲基(m/z15)、羰基(m/z28)、甲氧基(m/z31)、乙酰基(m/z43)……⑷分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z及相对丰度RA提供分子结构信息；⑸人机问答，给出可能的化合物。1.4.质谱能够提供的信息2.质谱仪的工作原理质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即其中z为电荷数，e为元电荷（e=1.60×10-19C），U为加速电压，m为离子的质量，为离子被加速后的运动速度。具有速度的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。2.1.工作原理221mvZeU根据质量分析器的工作原理，可以将质谱仪分为动态仪器和静态仪器两大类。•在静态仪器中用稳定的电磁场，按空间位置将m/z不同的离子分开，如单聚焦和双聚焦质谱仪。•在动态仪器中采用变化的电磁场，按时间不同来区分m/z不同的离子，如飞行时间和四极滤质器式的质谱仪。质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析系统和检测系统。为了获得离子的良好分析，避免离子损失，凡有样品分子及离子存在和通过的地方，必须处于真空状态。2.2.基本结构ComponentsofanyMassSpectrometerVacuumSystemSampleInletDetectorDataSystemMassAnalyserIonisationMethodAtmosphere1.直接进样2.GC或者LC进样1.EI2.ESI3.APCI4.Maldi1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆5.离子井2.2.1真空系统采用两级泵抽真空机械泵预抽空，真空度达10-1Pa再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。现代质谱仪采用分子涡轮泵可获得更高的真空度。离子源真空度：1.3×10-4-1.3×10-5Pa质量分析器：1.3×10-6Pa。2.2.2进样系统进样系统目的是高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低。在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。气体可通过储气器进入离子源。易挥发的液体，在进样系统内汽化后进入离子源。难挥发的液体或固体样品，通过探针直接插入离子源。常用的进样装置有：间歇式进样系统、直接探针进样、色谱进样系统（GC-MS、HPLC-MS）和高频感藕等离子体进样系统（ICP-MS）等。VacuumsealsCeramictipSample•直接探针进样气相进样填充色谱进样系统色谱柱较粗，直径4~6mm载气流速大，几十ml/min毛细管气相色谱柱进样系统载气流速小、柱子细，直接插入电离盒中。+HefromGCSampleSampleHeToMSVacuumpump包括液体泵进样和液相色谱进样。目前主要是液相色谱进样与电喷雾和大气压化学电离质谱联用。1）液体泵；进样注射器；毛细管输送样品到电喷雾尖端流速可控制在0.5~500l/min适用于纯样品的分析或进行质谱研究等。2）液相色谱仪进样系统将液相色谱流出物直接通过进样毛细管送到电喷雾电离源内。液相色谱流速问题。洗脱剂中的缓冲盐等问题。液相进样2.2.3离子源电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。离子源(ionsource)电子电离源(electronionizationEI)化学电离源(chemicalionizationCI)快原子轰击(fastatombombardmentFAB)电喷雾源(electronsprayionizationESI)大气压化学电离（atmosphericpressurechemicalionizationAPCI)基质辅助激光解吸电离（matrixassistedlaserDesorptionionizationMALDI)电子电离(EI)•EI是使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子，即M+eM++2e式中M为待测分子，M+为分子离子或母体离子。•上图是典型的电子轰击源的示意图。在离子源内，用电加热锑或钨的灯丝到2000℃，产生高速电子束，其能量为10～7OeV。当气态试样由分子漏入孔进入电离室时，高速电子与分子发生碰撞，若电子的能量大于试样分子的电离电位，将导致试样分子的电离.电子电离源(EI)主要用于GC-MS检测挥发性样品。是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测。样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.•优点•1.高的灵敏度•2.有达10万个化合物的数据库可快速检索•3.可根据碎片方式鉴定未知物•4.从碎片离子判定结构•缺点•1.质量范围小•2.有可能汽化前发生解离•3.碎片过多有时看不到分子离子化学电离(ChemicalIonization,CI)CI特点：利用反应气体的离子与样品分子相互反应使样品分子离子化，本质是化学过程。离子出口的缝隙减小，使高子室内的压力保持在0.5-1.0Torr。CI电离不直接作用于样品分子。CI源原理：化学电离源内充满一定压强的反应气体，如甲烷等，用高能量的电子（100eV）轰击反应气体使之电离，电离后的反应分子再与试样分子碰撞发生分子离子反应形成准分子离子QM+,和少数碎片离子。在CI谱图中,准分子离子峰往往是最强峰,便于从QM+推断相对分子质量，碎片峰较少，谱图简单，易于解释。特点：得到一系列准分子离子（M+1）+,（M-1）+，（M+29）+等等；CI源的的碎片离子峰少，图谱简单，易于解释；不适于难挥发成分的分析。电喷雾电离(Electro-SprayIonization,ESI)到达雷氏极限++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--蒸发++带电雾滴试样离子准分子离子++++++++--其他离子•电喷雾通常要选择合适的溶剂。•除了考虑对样品的溶解能力外，溶剂的极性也须考虑。•一般来说，极性溶剂（如甲醇、乙腈、丙酮等）更适合于电喷雾。•对于水溶液，由于液体表面张力较大，ESI要求的阈电位也较高。为了避免高压放电，可向喷雾区引入有效的电子清除剂或使离子源加热以降低表面张力。•通常小分子得到[M+H]+,[M+Na]+或[M-H]-单电荷离子，•生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。•电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；•其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。电喷雾电离(ESI)•优点1、适合同时检测3000分子量的多种物质2、软电离，很容易得到准分子离子峰。3、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。4、没有基质干扰，化学背景低适合低含量检测。5、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。6、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。7、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。8、特别适于测多肽的修饰。9、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。•缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物（如：碱金属和碱性化合物）特别敏感，污染难清洗。3、带多电荷，在分析混合物时，可能会产生混乱。大气压化学电离(AtmospherePressureChemicalIonization,APCI)是由ESI源派生出来的，常压下电晕放电。喷出的液滴先汽化，随后空气中某些中性分子（H2O,N2,O2等）及溶剂分子被电离，发生化学电离的过程。适用于弱极性的小分子化合物(M1000)。大气压化学电离(APCI)软的电离方式，样品直接从液体中拉出来的，不是蒸发，基本不产生分解，电离过程属于离子-分子反应，与CI原理相似。快速地适合高低含量水溶液的流动相，可作梯度分析。单电荷峰，实现源内CID。基质辅助激光解吸电离(MALDI)基本原理：将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样,当用激光(337nm的氮激光或355nm的固体激光器)照射晶体时,基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。离子源特点:1、使用脉冲式激光；2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系；3、离子化效率高，灵敏度高(fmol～amol)常用基质：芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。•高灵敏度，分析浓度至低fmol•软电离方式，主要产生单电荷离子，谱图易解析•能容忍一定的盐浓度：PBS20mM•线性TOF分析器可测