清洁水体与污染水体中微生物群落分布的测定

《环境微生物学》综合性实验——清洁水体与污染水体中微生物群落分布的测定陈凡2010240003710环科组员：陈凡傅永邦李炬华李骏斌曾锦萍何浩斌摘要：随着工业化和城市化进程的加快，我国河流普遍受到了不同程度的水质污染，而微生物指标对于水质评价具有重要作用。本实验在官洲河中选择清洁与污染区域分别进行采样，然后测定水体中微生物的种类和数量，染色观察，分析两种水体中微生物群落的分布特点以及污染物对水体中微生物群落的影响。关键词：官洲河、微生物、污水处理、分离纯化1前言在水生生态系统中,水生生物是物质循环和能量流动的中心环节。任何生态因子的变化都会使水生生物的群落结构发生相应的改变,反过来也可以通过了解生物群落的变化来了解水体的水质状况。特别是在水体污染的情况下,生物群落结构发生变化比自然条件下更加复杂、更加剧烈。通过对生物的个体生态系、种群生态系和群落生态系的研究,便可以了解生物体所处的环境特征,反映水质的瞬时变化,也可以连续观测水质变化,反映低浓度污染物对生物体的潜在危害。[1]本实验对官洲河的对照断面、控制断面、削减断面三个断面水体的微生物现状进行调查与分析,并进行科学评价。2实验方案与思路2.1水样的抽取与保存2.2水样微生物的观察2.3制备培养基2.4水体微生物分离纯化2.5单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养2.6菌种初步鉴定3实验方法3.1水样的抽取与保存3.1.1抽取水样根据上图，分别在官洲河排污口的上游（对照断面），污水处理厂下游（控制断面）及下游较远处（消减断面）取水样，用绳子绑住准备好的矿泉水瓶丢到河中央取水，水瓶不能装太满，大约2/3瓶，因为需留适量空气在瓶中防治水样中微生物过早死亡，并盖紧盖子以防污染；取水时间为早上10点至11点；所取水为表层水样。以下为取水位置：3.1.2水样的保存为防止微生物发生质的改变,装好的样品瓶要在绝热箱中运送。当外界温度较高时还要冷却,采样容器也不要受任何直接阳光照射,以免紫外线杀死微生物。采好的水样应立即送往实验室,一般从取样到检验不宜超过两小时,否则应使用10oC以下的冷藏设备保存样品,但不得超过6小时,实验室接到送检样品后,应将样品立即放入冰箱,并在两小时内进行检验,如果因路途遥远,送检时间超过6小时,应考虑采用延迟培养法。[2]3.2水样微生物的观察仪器与材料灭菌塑料瓶、光学显微镜、载玻片、盖玻片、水体样本3.2.1用压滴法制作水体样本的标本片取一片干净的载玻片放在实验台上，用滴管吸取样品于载玻片中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要有气泡）即成标本片，用低倍镜和高倍镜观察，要充分利用显微镜的移片夹的移动，注意观察微生物组成。制作方法如下图2所示。[3]图23.2.2用光学显微镜观察记录微生物形状及其活动方式，从而判断微生物种类；3.2.3水样微生物总数的测定3.3.2.1细胞计数（1）稀释：将样品稀释至合适的浓度。（2）加被测样品至血球计数板：取已洗净的血球计数板，将盖玻片盖住中央的计数室，用细口滴管吸取少量已经充分摇匀的菌液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静止5—10min，待菌体自然沉降并稳定后即可计数。（3）计数：先用低倍镜寻找大方网格的位置，找到计数室后将其移至视野的中央，再换高倍镜观察和计数。需不断地上、下旋动细调节轮，以便看到计数室内不同深度的菌体。3.3.2.2计算方法结果计算：先求得每中格菌数的平均值，乘以中格数，即为一大格中的总菌数，再乘以104，则为每毫升稀释液的总菌数，再乘以稀释倍数即为原液的总菌数[4]。两种不同规格的血球计数板的计算方法如下：（1）16×25的计数板计算公式：细胞数（mL）＝（100小格内的细胞数/100）×400×10000×稀释倍数（2）25×16的计数板计算公式：细胞数（mL）＝（80小格内的细胞数/80）×400×10000×稀释倍数3.3制备培养基仪器与材料高压蒸汽灭菌器、培养皿、试管、烧杯、量筒、药物天平、玻璃棒、石棉网、药匙、pH试纸、酒精灯、锥形瓶、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH、琼脂、3.3.1玻璃仪器准备：洗涤→包装→高压蒸汽灭菌→分装→冷冻保存3.3.2培养基的配制：①成分：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，淀粉2g，蒸馏水1000ml。②方法：取牛肉膏0.5g，加水100ml，再加入蛋白胨、氯化钠、加热使之完全溶解，调整pH值至7.2～7.4，分装，高压灭菌后备用。向灭菌后冷却至50—60oC的培养皿倒入一定量的灭菌后的溶液，将培养皿放置于无菌室冷却备用。【液体培养基的组成(g/100mL):NaH2PO4*2H2O0.1g,MgSO4*7H2O0.05g,蛋白胨0.5g,葡萄糖1g,pH自然。】3.4水体微生物分离纯化仪器与材料酒精灯、锥形瓶、接种环、恒温培养箱3.4.1平板划线法用接种环挑取一环菌种，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿划破培养基），划线的方式为3组不相接的折线。划线完毕盖好皿盖，倒置于37摄氏度恒温培养箱内培养24-48h后观察结果。同操作做2次（即2个培养基）。3.4.2斜面接种灼烧接种环后，在酒精灯环境下，将冷却了的接种环伸入培养基中，挑取菌种。打开斜面培养基的棉塞，并在火焰上微烧一周，将已接种的接种环立即转移至斜面上，自斜面底部开始向上做“Z”型致密划线至斜面顶端。抽出接种环，试管过火后塞上棉塞，将试管放回试管架。灼烧接种环，杀灭环上细菌。同操作做3次（即3个斜面）。送培养箱（37摄氏度）培养，待看结果。3.5单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养仪器与材料酒精灯、培养基（液体3个）、锥形瓶（3个）、接种环、恒温培养箱稀释水、实验1的斜面培养基3.5.1液体接种灼烧接种环后，在酒精灯环境下，将冷却了的接种环伸入斜面培养基中，挑取菌种。取种后将沾有菌种的接种环送入液体培养基，使环上的菌种全部洗入培养基中，抽出接种环并灼烧，试管过火后塞上棉塞，将培养液轻轻摇动，使菌体在液体培养基中分布均匀，送培养箱（37摄氏度）培养，待看结果。3.6菌种初步鉴定仪器与材料载波片、接种环、酒精灯、无菌水、草酸铵结晶紫染液、革兰氏碘液、95%乙醇、番红溶液3.6.1先观察实验1做出的三个培养基，观察及记录其菌落的大小、形状、表面结构、隆起度、边缘结构、菌从高度、表面性状、颜色、透明度、气味、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况和干湿度等综合情况。3.6.2菌种的革兰氏染色在载玻片上滴一小滴无菌水。烧接种环，在酒精灯环境下，将冷却了的接种环伸入斜面培养基中，挑取菌种。将菌种涂布在水滴上并涂成一均匀薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，然后来回通过火焰3-4次固定菌种。冷却后滴加草酸铵结晶紫，静待1min后西区多余染剂，干燥，再换革兰氏碘液重复，再用乙醇脱色（直到流出液体无颜色为止），干燥后滴加番红溶液重复，用光学显微镜观察记录菌种颜色及形状。4结果与讨论4.1水样初步观察压滴法装片观察微生物形态特征，图片如下：水样一（对照断面）：杆状轮虫线状钩刺斜管虫藻类有鞭毛、会游动圆形发光线虫或寡毛类动物酵母菌、大量透明短杆状轮虫、点状藻类水样二（控制断面）：数量、种类较少孢子变形虫或藻类链状藻类水样三（消减断面）：裸藻纤毛虫盘星藻属藻类4.2水样微生物计数中格1（个）中格2（个）中格3（个）中格4（个）中格5（个）平均值（个）总数（个/mL）水样一1316111013133.25×106水样二3850564448471.18×107水样三8880849688872.17×1074.3菌落观察4.3.1培养基菌落观察水样一(对照断面)：很多菌落,大于100个,有大菌落,有小菌落,其中一个菌落含有白色绒毛状的菌丝,体积较大；有2个乳白色大小相似的菌落，菌落中间有点点呈透明状（数量不多），边缘不规则，根状，隆起，表面粗糙；有大概20个菌落，呈圆形状，表面光滑，乳白色，隆起，边缘光滑；有大概3个菌落，表面平坦，有同心环，里面为红褐色，第二个环为乳白色，最外层为白色透明，边缘不规则，根状；有4~5个菌落呈点状，橙红色，隆起，边缘整齐，表面光滑；有很多菱形状的淡黄色小菌落。水样二（控制断面）：约40个菌落，大概分三种1.乳白色，大，圆形边缘，表面光滑，高凸起，约5~6个2.乳白透明，中，边缘整齐，表面光滑，隆起，约5~6个3.米黄色，小，边缘整齐，表面光滑，隆起，约25个水样三（消减断面）：大于100个，大概分为7种1.深绿色，小，边缘整齐，表面光滑，高凸起，约10个2.黄色，小，边缘整齐，表面光滑，隆起，约10个3.有同心环，两层，外层白色，里层褐色，大，边缘不规则，呈放射状，粗糙，扁平，约5个4.乳白色，大，边缘不规则，呈放射状，表面光滑，扁平，约20个5.米黄色，中，边缘不规则，似菌状，表面光滑，扁平，约10个6.米黄透明，有大有小，边缘规则整齐，表面光滑，隆起，约40个7.白色，小，边缘规则整齐，表面光滑，草帽状，1个4.3.2菌体染色观察水样一（对照断面）：紫色颗粒状革兰氏阳性菌紫色毛发状，成团紫色链杆革兰氏阳性菌颗粒状，分布呈鱼鳞状水样二（控制断面）：革兰氏阴性菌颗粒状水样三（消减断面）：杆状蓝紫色颗粒状紫黑色颗粒状紫色单球菌紫色短杆状；长长的丝状菌4.4实验结果与分析实验结果：对照断面的微生物种类最多，以虫类及微型动物为主，但数量最少，大约3.25×106个/mL；控制断面的微生物种类最少，以藻类为主，数量较多，1.18×107个/mL；消减断面的微生物种类数量较多，有虫类和藻类，数量最多，2.17×107个/mL。分析：水体微生物主要有两种：1.清水型水生微生物在洁净的湖泊和水库中，因有机物含量低，故微生物数量很少(10—103个／m1)。典型的清水型微生物以化能自养微生物和光能白养微生物为主，如硫细菌、铁细菌和衣细菌等，以及含有光合色素的蓝细菌、绿硫细菌和紫细菌等。也有部分腐生性细菌，如色杆菌属、无色杆菌后和微球菌属的一些种就能在低含量营养物的清水中生长。单细胞和丝状的藻类以及一些原生动物常在水面生长，不过它们的数量一般不大。2.腐败型水生微生物流经城市的河水、港口附近的海水、滞留的池水以及下水道的沟水中，由于流入了大量的入畜排泄物、生活污物和工业废物等，因此有机物的含量大增，同时也加人下大量外来的腐生细菌，位腐败型水生微生物尤其是细菌和原生动物大量繁殖，每毫升污水的微生物含量达到107—108个。其中数量最多的是无芽孢革兰氏阴性杆菌，如变形杆菌肩、产气肠杆菌阂和产颁杆菌后等，还有各种芽孢杆菌属、弧菌属和螺菌属的一些种。原生动物有纤毛虫类、鞭毛虫类和根毛虫类。这些微生物在污水环境中大量繁殖，逐渐把水中的有机物分解成简单的无机物，同时它们的数量随之减少，污水也就逐渐净化。[5]理论上，一般未受污染的水体细菌数量很少，如果细菌总数增多。表示水体可能受到有机物的污染，细菌总数越多，污染愈严重。工业废水、生活污水排放而使废水含有大量微生物，因此，菌总数常作为评价水体污染程度的一个重要指标[6]。即排污口后的河水中微生物的种类数量会大量增加，但是经过污水处理厂的处理后又会大量减少，因为污水处理厂的各种处理工艺使得水里的有机物大量减少，并紫外线杀菌，杀死微生物，故污水处理厂排出的水中微生物数量会大量减少。而后随着水体的流动，有机物等又会慢慢增多，从而水中的微生物种类数量又会慢慢增多。因为对照断面的水样中微生物数量较多，且种类以虫类偏多，主要存在的并不是清洁型水生微生物，有革兰氏阳性菌，故可以判断其不是清洁水体，已经受到了一定的污染；而控制断面的水样中微生物数量较多，与污水水体理论含量差不多，说明污水处理厂起到的污水处理作用很弱，并不能有效降低水体中有机污染物和污染微生物的含量，存在的微生物种类仍以藻类为主，有革兰氏阴性菌，说明处理后的水体中仍有部分有机物及腐生型水生微生物，污水处理不彻底；而随着水体的流动，水体中的有机物等逐渐增多，微生物种类及数量逐