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RNA的干扰RNA的干扰RNA干扰是什么RNA干扰的发现RNA干扰的作用机制RNA干扰的应用RNA干扰RNA干扰存在的问题什么是RNA干扰？•英文：RNAinterference，缩写RNAi。•概念：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象RNA干扰的发现2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。1995199219911990Napoli等尝试在有颜色的矮牵牛(Petuniahybrida)花翼瓣中通过介入CHS基因使查尔酮合成酶过量表达,来加深花瓣的颜色。出人意料的是,花瓣颜色不仅未加深,而且42%的介入CHS基因的植物的花全部变白或有白色或灰白图案。Fire等把RNA注入新秀杆线虫以控制基因的表达Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象。罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达2002200019991998美国华盛顿卡耐基研究院的Fire等在研究RNA干扰所需的结构和传递条件的试验中发现,把dsRNA正义链和反义链的混合物注入线虫体内,比注入单独的任意一个正义链或反义链的效果均要好。Hamilton等首次在PTGS植株中发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现，外源性dsRNA通过耗能过程降解成21-23nt的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）引发RNAi。Brummelkamp等首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达，为利用RNAi技术进行基因治疗研究奠定了基础。Wianny和Svoboda等分别证实在小鼠胚胎细胞和卵母细胞中dsRNA能引发RNAi效应。2001年，Elbashir等证实21nt的siRNA可在避免激活dsRNA依赖的蛋白激酶和2',5'-寡聚腺苷酸合成酶信号转导途径的同时，有效抑制人胚肾293细胞、Hela细胞等哺乳动物细胞中目的基因的表达。RNAi的作用机制RNAi的机制和过程大致分为以下几个阶段进行：(1)siRNA的形成阶段；(2)RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)形成阶段；(3)效应阶段；(4)扩增阶段。RNAi机制外源病毒转座子目标识别内切酶切割目标外切酶降解RNARdRP合成RNA激活的siRNA复合物双链siRNA异常ssRNARdRP合成RNA二级siRNA目前，RNAi的作用机制主要是在线虫、果蝇和拟南芥等生物体内阐明的。生物体由于RNA病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列(invertedrepeats)转录及外源基因导入等原因，细胞中可出现dsRNA分子。当各种原因产生的dsRNA在细胞中出现时，细胞中一组特定蛋白复合物可识别dsRNA，此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dicer结合，然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21~25nt大小的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。(1)siRNA的形成阶段核酸内切酶核酸外切酶解旋酶Dicer同源搜索活性siRNAslongdsRNADicercontainstwoRNAseIIIdomainsDicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21~25nt大小在3’端带有2~3个碱基悬端和5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。19ntduplex2nt3’overhangssiRNAshaveadefinedstructuresiRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNaseⅢ核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt~23nt的siRNA呢?最近对RNaseⅢ催化结构域的结构的研究使其真相大白。Dicer一种核酸酶,负责将dsRNA转化为siRNA：它属于RNaseⅢ家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA长度存在微小差别。DicerModelsforDicercleavage启始阶段加工酶加工成21-23核苷酸片段DicerRISCmRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解①②siRNA的形成siRNADicerRISC(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-inducedsilencingcomplex），具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)(3)效应阶段siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5’起始端下游7~10个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。效应阶段mRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解解旋酶核酸外切酶同源性检索活性核酸内切酶RISC在这些机制中，RISC是一个很灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。RISC复合物的核心负责接受从Dicer加工来的小RNA，并用该小RNA作为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。RISCRNA-inducedSilencingComplex解旋酶核酸内切酶ArgonauteproteinsiRNAmRNA250KD(inactive)100KD(active)ATP11/22/2020(4)扩增阶段该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。RNAi扩大效应目前，对这些现象的解释至少有四种机制：①Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级siRNA”，再由后者降解同源的mRNA，故dsRNA的长度决定了放大效应的水平；②siRNA在酶作用中，可多次利用，能进一步提供放大的信号；③移行RNAi(transitiveRNAi)中，siRNA可作为靶mRNA的引物，在RdRP和Dicer等的作用下产生“次级siRNA”，导致沉默信号的扩增。④“异常RNA”(aberrantRNA)无需引物，可在RdRP的作用下生成dsRNA，并由Dicer酶切生成siRNA。以上四种机制中，尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增及传递提供了重要线索。移行RNAi移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特定的mRNA由3’5’方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA，而是在细胞中RdRP的作用下，以初级siRNA的反义链为引物，以靶mRNA为模板，生成dsRNA，随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA，称为次级siRNA。除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外，其他与RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA参与沉默信号的扩增。此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：(1)Dicer将长dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于dsRNA的长度；(2)siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。应用：RNAi主要通过在转录后（post-transcriptional）水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shuttingoff）非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路。药物开发RNAi的应用领域病毒性疾病的治疗基因功能研究241肿瘤治疗31）基因功能研究由于RNAi技术可以利用siRNA使目的基因沉默，研究基因的功能。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。2）病毒性疾病的治疗RNAi机制作为真核生物基因组免疫系统,抑制外源和内源有害基因表达。利用RNAi技术把与病毒基因具同源性的siRNA引入感染细胞将会抑制病毒的增殖。利用RNAi技术抑制过度表达的癌基因将会使癌症表型逆转或病程得以控制。研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi抑制了HIV-1的coreceptor(辅助受体)-CCR5进入人体外周Ｔ淋巴细胞，不影响另一种HIV-1的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。•。••Randall等证明了针对HCV(丙型肝炎病毒)RNA的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍；将siRNA转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCVRNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等也证明了siRNA特异抑制HCVRNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。Fig3.RNAi的抗病毒机制3）肿瘤治疗用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达，(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。4）药物开发•。利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快