逆转录

第四节逆转录与RT-PCRReversetranscription&RT-PCR2020/11/222一、逆转录和逆转录酶的发现实验现象：1、1964年，Temin等首次发现：DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒ASV等RNA肿瘤病毒所造成的感染表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成DNA。2、ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。2020/11/223假想：•DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物•这一过程大致为：RNA肿瘤病毒－DNA原病毒（或前病毒）－RNA肿瘤病毒。2020/11/224证明：1970年，Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶(reversetranscriptase)。HowardTeminandDavidBaltimore于1975年荣获诺贝尔生理与医学奖。2020/11/225二、逆转录病毒（retrovirus）1.定义：含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的逆转录病毒都致癌。2.逆转录病毒的基因组：逆转录病毒基因组由两条相同的正链RNA分子组成，每个约8,500nt，其5‘端有cap，3’端有ployA尾。2020/11/2262020/11/227三、逆转录酶（reversetranscriptase）定义：是RNA指导的DNA聚合酶。具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和RNaseH的活性。合成DNA的方向：逆转录酶合成DNA的方向为5’－3’。2020/11/228合成DNA的引物：•不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的tRNA分子。•一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp为引物，而鼠类逆转录病毒则以宿主细胞tRNAPro为引物。•RNaseH活性：是指逆转录酶可以从5’－3’和3’－5’两个方向水解DNA-RNA杂合分子中的RNA。2020/11/229四、逆转录1.逆转录（reversetranscription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。2020/11/22102.逆转录病毒基因组复制过程•在逆转录过程中，新合成的DNA链要发生两次“跳跃”（jump），以改变链间碱基配对的位置，使双链DNA的两端产生相同的长末端重复序列LTR(longterminalrepeats)。•LTR中含有整合信号、转录信号（启动子）、增强子和polyA位点等序列，通常只有左侧LTR中的启动子和右侧LTR中的polyA位点发挥正常功能，这是由它们所在的位置所决定的。2020/11/22112020/11/2212逆转录原理的应用－RT-PCR反转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）：是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链扩增（PCR）相结合的技术。2020/11/2213RT-PCR过程•首先经反转录将RNA逆转录成cDNA•然后以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段。2020/11/2214模板RNA：总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。2020/11/2215•用于反转录的引物可视实验的具体情况选择：随机引物（randomhexamer）、OligodT及基因特异性（gene-specific）引物中的一种。•对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。2020/11/2216•OligodT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。•随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。•基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。2020/11/22172020/11/22182020/11/2219注意事项1.在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。3.内参的设定：主要是为了用于靶RNA定量。常用的内参有Tublin、β-Actin等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一等所造成的误差。2020/11/22204.PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。5.防止DNA污染：（1）采用DNA酶处理RNA样品。（2）在可能情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。2020/11/2221RT-PCR的用途1.检测细胞中基因表达水平；2.检测细胞中RNA病毒的含量；3.直接克隆特定基因的cDNA序列。2020/11/22222020/11/22232020/11/2224一、mRNA差别显示技术概述1992年，哈佛大学医学院的PengLiang和ArthurB.Pardee博士于创建发明的mRNA差别显示法，即DD法（differentialdisplayofmRNAbyPCR）；也称为差示反转录PCR（DifferentialDisplayofReverseTranscriptionalPCR）简称为ddRT-PCR，是一种新的研究基因差异表达的有力工具；它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。2020/11/2225DD法的主要程序：将细胞内的mRNA抽提出来，反转录成cDNA，经PCR随机扩增，通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因，并回收这些DNA片段，经扩增后作为探针，在cDNA或基因组DNA库中扫描找到相关基因。原则上如果选用不同的引物组合，这个方法可以检测到细胞中约15,000种不同基因的表达情况，这就给出了一个类似于蛋白质双向电泳的指纹图谱，基因表达的不同马上就可以知道，并因此分离到该基因。2020/11/2226二、mRNA差别显示技术基本原理合成两组引物，随机组合1利用真核生物mRNA具有多聚腺苷酸（polyA）尾巴的特点(PolyA序列起点前2个碱基除AA外只有12种可能性)，设计了一组10~12个寡聚胸腺嘧啶，同时再附加AGC三种核苷酸中的任意两种作为mRNA3′端的锚定引物，其通式为5’-T11MN；即采用Oligo（dT）12MN为引物合成cDNA，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类。用这些引物在反转录酶的作用下合成cDNA的第一条链。2020/11/22272为扩增出polyA上游500bp以内所有可能性的mRNA序列，在5′端设计了20种10bp长的随机引物。以合成的cDNA第一链为模板，在PCR反应中，掺入32P或35S标记的dATP或dCTP，这样正常与异常细胞间差异表达的cDNA片段可以通过DNA测序凝胶显示出来，3经过Northern杂交分析确证后，这些差别显示的cDNA可以作为探针，用于进一步分离cDNA及基因组克隆，达到最终分离基因的目的。这样构成的引物对进行PCR扩增能产生出20,000条左右的DNA条带，其中每一条都代表一种特定mRNA种，这一数字大体涵盖了在一定发育阶段某种细胞类型中所表达的全部mRNA。2020/11/2228DD法依赖三种技术：（1）mRNA逆转录技术；（2）以特定引物进行的PCR技术；（3）DNA测序胶电泳技术。2020/11/2229返回2020/11/2230三、mRNA差别显示技术的实验流程↓↓对照组的总RNA提取mRNA完整性鉴定实验组的总RNA提取mRNA完整性鉴定↓↓锚定引物逆转录成cDNA锚定引物逆转录成cDNA↓↓采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增扩增产物进行凝胶电泳分析2020/11/2231差异性条带的回收与第二次扩增Northern杂交，Southern杂交再次确定差异性条带的真实性差异性条带的克隆、测序、分析，DNA及氨基酸序列联机检索以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因序列及cDNA文库中的全长cDNA序列2020/11/2232基因功能的鉴定：①knockout②dominantnegativemutation③原核系统或真核系统中的表达翻译。④onehybrid判断出该基因的“启动”基因。⑤twohybrid判断出该基因的产物的作用途径。返回2020/11/22332020/11/22342020/11/22352020/11/22362020/11/22372020/11/22382020/11/22392020/11/22402020/11/22412020/11/22422020/11/22432020/11/22442020/11/22452020/11/2246