真核基因表达系统

第八章真核表达系统Chapter8Eukaryoticexpressionsystem•概述(introduction)•真核基因结构及表达调控特点(Featuresofeukaryoticgenestructureandregulation)•真核表达系统(eukaryoticgeneexpressionsystem)酵母表达系统(yeastexpressionsystem)哺乳动物细胞表达系统(mammaliancellexpression)昆虫细胞表达系统(insectcellexpression)内容第一节概述二、原核表达系统的局限性三、真核表达系统的必要性及优势一、真核基因组的复杂性1.真核基因组巨大大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因2.真核生物遗传信息复杂原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。3.真核生物基因协调表达4.真核生物基因编码复杂原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitivesequences)。真核生物mRNA5’有帽状结构，3’末端有PolyA尾巴1、没有转录后的剪接和加工系统2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。二、原核表达系统的局限性3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定易被细菌蛋白酶降解;难实现真正的分泌出胞，其产量很低;而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低4、内毒素的污染(contaminationofendotoxin)1.具转录后加工系统:2.具翻译后修饰系统3.可实现真正的分泌表达三、真核表达系统的必要性及优势(advantagesofeukaryoticexpressionsystem)（一）真核基因表达调控特点---多层次、多方面（二）真核基因表达的调控模式第二节真核基因表达调控特点FeaturesofEukaryoticgenestructureandexpression真核基因表达的调控模式(Theregulatingmodelofeukaryoticgeneexpression)1、转录前水平(基因组水平)：genelevel2、转录水平调控:transcriptionlevel3、转录后调控:post-transcriptionlevel4、翻译水平的调控:translationlevel5、翻译后修饰:post-translationmodification1、转录前水平(基因组水平)：genelevel基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋白修饰，DNA甲基化等2.转录水平调控顺式调控元件(cis-actingelement)反式作用因子(trans-actingfactor)（1）顺式调控元件(cis-actingelement)结构基因周围能与特异转录因子结合而启动转录的DNA序列，主要包括：•起正性调节作用：启动子、增强子•起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号启动子位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括•核心启动子元件（corepromoterelements)：指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的TATA-box•上游启动子元件（upstreampromoterelements)包括-70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的基础效率•组织特异性元件•诱导性启动子元件真核启动子结构模式图核心启动子元件上游启动子元件哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件元件名称共同序列结合的蛋白因子名称分子量结合DNA长度TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bpOct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp增强子(enhancer)•是一种能够提高转录效率的顺式调控元件•增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动子没有严格的专一性•无方向性（序列、位置）•远距离作用（1-4kB）•无基因特异性•具组织特异性构建载体沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer)是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式与增强子相同转录终止信号：控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加尾信号（AATAA）和polyA下游的G/T簇构成（2）反式作用因子(trans-actingfactor)由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。转录信号1PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA结合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinBDNA3、转录后的修饰•内含子的剪接•外显子的拼接•mRNA的加尾和加帽•mRNA的稳定性4、翻译水平的调控主要是microRNA对mRNA、tRNA和rRNA的调控5、翻译后的调控•切除信号肽•糖基化•乙酰化•磷酸化•甲基化•蛋白质的降解第三节真核表达系统组成：真核表达载体受体细胞真核表达载体适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。真核载体根据受体不同，又可分为几种：•酵母表达载体•哺乳动物细胞表达载体•昆虫杆状病毒表达载体受体细胞据受体细胞及表达载体的不同分为3种：•酵母表达系统•哺乳动物细胞表达系统•昆虫细胞表达系统•发酵简单、快速、便宜•真核生物，有翻译后修饰功能•可分泌表达，简化了纯化工艺•受体细胞安全一、酵母表达系统（一）酵母载体:1、概念：携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。2、组成元件：遗传标记调控序列1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定营养标记基因：亮氨酸（Leu）抗生素选择标记基因：Zeocin2）调控序列•ARS：酵母复制起始区(点)•酵母启动子：常用的有:PGK(磷酸甘油激酶)GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶）ADH1(醇脱氢酶)SUC(蔗糖酶)Apase(碱性磷酸酶)•酵母着丝粒区段(CEN)：增加转化子稳定性3、类型(types)•酵母克隆载体(yeastclonevector)：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如YIP、YRP、YEP•酵母表达载体(yeastexpressionvector)：酵母克隆载体+酵母启动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体•酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)克隆大片段DNA，2μM质粒：酵母核质中的小的环状DNA，可以独立复制并转录。（1）酵母克隆载体的构建•酵母整合型质粒(yeastintegratedplasmid.Yip)细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低。•酵母复制型质粒(Yeastreplicableplasmid,YRp)细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差•酵母附加子型质粒,YEp：细菌质粒DNA+酵母标记基因(YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制酵母复制序列酵母2μM质粒（2）酵母表达载体•特点：含酵母启动子穿梭载体(shuttlevector)：既可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。•种类：啤酒酵母表达载体毕赤酵母表达载体：分泌型表达载体非分泌型表达啤酒酵母表达载体毕赤酵母表达载体------整合型(3)酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC)----克隆大片段DNA由下列元件组成酵母染色体2umDNA的复制起始区着丝粒序列（CEN)四膜虫端粒DNA(TEL)•YAC:利用酵母的着丝粒区段（CEN）、自动复制序列（ARS）及四膜虫端粒DNA(TEL)构建的人工染色体•结构：左臂：TEL、选择标记、ARS、CEN右臂：TEL、选择标记•特点：容量大（50-1000kb），稳定性差•作用：构建基因组文库二）受体细胞1.啤酒酵母：较早使用，了解清楚安全性高，被FDA确认为安全生物表达量较低过量糖基化转化子不稳定，易发生质粒丢失2.毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞•高表达（12g/L）•高稳定-----载体为整合型•高分泌（10g/L）三）转化1.原生质体法：去除厚壁2.电穿孔法：效率较高，整合型载体转化前要酶切线性化3.LiCl法：做成感受态细胞四）外源基因在酵母菌中的表达1、胞内表达：直接表达外源基因，如：HBsAg的酵母重组疫苗2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列，pGAPZ,利用因子分泌表达五）高表达的策略（1）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能力强的GAP启动子（2）提高整合拷贝数：可利用载体中提供的抗生素遗传标记，以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。（3）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变发酵培养基的PH值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均可避免产物被降解。（4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。酵母双杂交系统YeastTwo-HybridSystem酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(BindingDomain,BD)和转录活化结构域(ActivationDomain,AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。基本原理在利用G