液相色谱教程(三)相色谱实验操作

液相色谱教程(三)液相色谱实验操作Waters中国有限公司培训中心©2004WatersCorporation启动液相色谱仪器的流程开启HPLC系统各个设备的电源–打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件准备流动相–过滤,脱气色谱泵排气–用新配制的流动相灌注泵©2004WatersCorporation启动液相色谱仪器的流程用准备好的流动相平衡色谱系统–可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在软件控制下操作)–系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作准备样品–用流动相溶样或重组样品编制仪器方法,开始实验©2004WatersCorporation液相色谱对流动相的要求色谱柱对流动相的要求–过滤除去微粒–纯度的要求超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，并与填料相匹配–缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内–缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM)–流动相对样品的溶解度调整有机溶剂和水的比例最好用流动相溶样©2004WatersCorporation液相色谱对流动相的要求液相色谱仪器对流动相的要求∶–与检测器匹配–脱气–避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）–溶剂的粘度–防止细菌的生长©2004WatersCorporation流动相的脱气流动相脱气的目的–使色谱泵的输液准确输液量均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高–提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低–保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化©2004WatersCorporation流动相脱气的方法加热–简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空–同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波振荡–简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)通惰性气体（一般用氦气）–可保持在线连续脱气，多用于低压梯度在线脱气机（in-linedegasser)–可保持连续脱气，多用于低压梯度©2004WatersCorporation流动相的保存有机溶剂流动相:–室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:–当日现配现用–低温下密封保存,一般不超过3天–防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:–低温密封保存–防止有机相的挥发选用适宜的容器©2004WatersCorporation2星期1天1星期1小时新鲜配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超纯水测试条件水样:40mltraceenrichment@2.0ml/min色谱柱:C18反相柱(Waters)梯度:线性100%水－100%乙腈波长:254nm©2004WatersCorporation1天1星期新鲜配制5101520250分保存于棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件水样:40mltraceenrichment@2.0ml/min色谱柱:C18反相柱(Waters)梯度:线性100%水－100%乙腈波长:254nm©2004WatersCorporation色谱泵的排气操作色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：–将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中–打开泵及在线脱气机电源开关–将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路–设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出–必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相–对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作–停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十Psi以内),否则,需重做排气操作©2004WatersCorporationWaters515泵的前面板电源开关柱塞杆清洗孔排液阀©2004WatersCorporationWaters600泵的前面板柱塞杆清洗孔电源开关排液阀泵控制器泵体泵灌注阀©2004WatersCorporationWaters2695分离单元溶剂瓶盘注射器箱门柱温箱溶剂配比单元进入门检测器接液盘前面板显示屏和键盘软盘驱动器样品室门溶剂输送单元进入门©2004WatersCorporation2695排气操作示意图面板操作:–打开状态(Statas)画面–按右下角DirectFunction功能键–选DryPime或WetPrime命令–选OK即可进行泵的排气注:–当流路中充满空气时,按图示做DryPrime–若只是更新流动相时,只须作WetPrime©2004WatersCorporation关于色谱系统的反压什么是反压(backpressure)–流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,又称系统反压或系统压力–Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋)–其它单位有:Bar,Mpa影响系统反压的主要因素:–流动相的溶剂组成–温度–流速©2004WatersCorporation反压与溶剂组成的关系Pressurevs.Organic-WaterPercentage02004006008001000120014001600020406080100PercentOrganicSolventpsiMeOHACN流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂－水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示©2004WatersCorporation反压与流速的关系流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大下图的实验条件：–2.1×30mmSymmetryC18柱,20℃Pressurevs.FlowRateat20?C05001000150020002500300035004000450050000.00.20.40.60.81.01.2mL/minpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN©2004WatersCorporation反压与温度的关系温度对反压的影响是反比关系温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些Pressurevs.Temperature050010001500200025003000350040004500500010.020.030.040.050.060.070.0Degrees,Cpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN©2004WatersCorporation影响系统反压的其它因素反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比–2.5μm填料比3.5μm填料反压高反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)反压与管路的长度成正比©2004WatersCorporation色谱泵的运行排气后的色谱泵即可用于实验运行–注意∶排气后，先设流速为0恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱如需要，恢复排气时断开的控制线根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作)©2004WatersCorporation色谱泵的维护保养流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中©2004WatersCorporation液相色谱系统的清洗与钝化色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜©2004WatersCorporation色谱泵及系统的清洗清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀清洗步骤如下:–取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器–用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)–用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分钟(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)–换成清水洗至出口水pH显中性–用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用©2004WatersCorporation色谱泵及系统的钝化钝化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀钝化步骤如下:–在清洗步骤完成后进行钝化处理–确认清洗用的磷酸已基本洗净–用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%)–用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分钟–换成清水洗至出口水pH显中性–用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用©2004WatersCorporation实验样品的制备标样和样品–标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参考标准物,一般是纯度较高的纯物质–样品:待测物,一般是成分复杂的混合物液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:–必须能溶于流动相如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱–样品溶液要过滤除去微粒及杂质–了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用©2004WatersCorporation复杂样品的预处理样品预处理的目的–除去微粒–减少干扰杂质–浓缩微量的组份–提高检测的灵敏度及选择性–改善分离的效果–有利于保护色谱柱及仪器©2004WatersCorporation样品预处理的重要性是影响实验成败的决定性步骤占样品分析时间的比例最大–样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间占分析消耗总成本的比重最大–消耗大量的溶剂及其它化学品对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节–影响实验结果好坏的最重要因素©2004WatersCorporation样品预处理常用的方法高速离心取上清液过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-液萃取固相提取(SolidPhaseExtract,SPE)–Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它©2004WatersCorporation去除微粒的方法过滤–过滤膜/过滤装置有机滤膜(≤0.5µm)/水溶性滤膜(≤0.45µm)膜片可更换–一次性使用的膜“Cartridge”使用方便简单，交叉污染小有更小内径，可用于微量样品的处理高速离心大于：10,000rpm©2004WatersCorporation超滤机理–超滤是一种基于分子量分离的技术目的–根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份–除去小分子样品中的大分子蛋白–脱盐©2004WatersCorporation选择性沉淀常用于生化样品中除蛋白–有机溶剂乙腈，甲醇–强酸三氯乙酸，高氯酸–盐50%硫酸铵10%TCA(三氯乙酸钠)©2004WatersCorporation样品衍生提高检测的灵敏度–增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度–增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器改变分离的选择性–改变组份的基团，如：变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离典型的例子–柱前衍生氨基酸分析©2004WatersCorporationAccQ-Tag衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN++AQC衍生试剂１°及２°氨基酸衍生后的氨基酸CO2N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺半衰期＜1秒半衰期约15秒6-氨基喹啉©2004WatersCorporation浓缩样品目的：富集微量或痕量组份浓缩样品的方法–萃取/吹干–沉淀/再溶解–色谱法–固相提取Oasis小柱Sep-Pak小柱©2004WatersCorporationOasisHLB固相提取小柱亲水-亲脂平衡共聚物“亲水”–使填料具有水可浸润性质–降低与水的接触角“亲脂”–提供对被分析物质的