基因工程技术

基因工程技术临五1408班四组4小组题目已知目的基因的cDNA序列(GenBank登录号:AK135903.1)，拟采用基因工程技术在哺乳动物细胞中表达该序列中的133-1941位核苷酸序列，请设计实验方案。目录三﹑目的基因导入受体细胞四﹑目的基因的检测与表达一﹑目的基因获取二、目的基因与载体结合目的基因的获取一、PCR引物设计原理二、检索及设计引物序列三、cDNA获取和扩增一、PCR引物设计原理引物设计目的:为了找到一对适合的核甘酸片段，使其能有效的扩增模板DNA序列。引物的优劣与PCR的成功密切相关。引物设计原则：课本P1641.碱基要随机分布2.G+C含量在40%~60%之间3.引物之间和引物自身不能有连续4个碱基的互补4.引物长度在10~30个碱基之间5.避开二级结构区6.3'端不可修饰，避免使用T7.5'端可以修饰Genbank检索进入输入登入号：AK135903.1二，检索及设计引物序列小鼠体外受精卵的cDNA日本理化研究所全长序列文库卵透明带糖蛋白2完整的插入序列该cDNA序列共有2234个bp的碱基检索结果Genbank检索二，检索及设计引物序列查找到的全长基因序列Genbank检索结果二，检索及设计引物序列1.小鼠卵透明带糖蛋白2的mRNA提取2.mRNA逆转录为cDNAmRNA有poly(A)尾→oligo(dT)cDNA的获取三，cDNA获取和扩增提取出雌性小鼠的卵细胞中的所有RNA得到以下结果:在pubmed找到AK135903.1的cDNA序列后，使用DNAman进入页面即可筛选出建议的引物，经过前面的引物设计原则分析后得到一对包含133-1941位点的扩增引物。设计引物过程二，检索及设计引物序列3.cDNA形成双链进行扩增cDNA的扩增三，cDNA获取和扩增扩增后就可以得到高浓度的cDNA目的基因与载体结合一、载体的选择二、表达载体的构建一、载体的选择选择载体主要依据目的，同时要讨论载体中应有适合的酶切位点，如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。1.题目中得到的扩增cDNA序列10K，一般选择用质粒做为表达载体。2.获得人工质粒载体分子(PBR322)比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13噬菌体克隆容量(K)102240~501基因组DNA文库—＋＋—cDNA文库＋＋——亚克隆＋——＋序列分析＋＋—＋大肠杆菌表达＋＋——注:＋表示可用，—表示不可用质粒载体(PBR322)优点:1.相对分子质量较小2.带有一个复制起始位点3.具有两种抗生素抗性基因:氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。4.具有较高的拷贝数，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。一、载体的选择二、表达载体的构建载体处理及体外连接1.碱性磷酸酶处理载体(去掉线性DNA分子5'端磷酸根，防止质粒自身环化，便于与基因片段连接)2.人工合成的基因接头常常在表达载体有特殊的限制性核酸内切酶的位点，用相同的限制酶(BamHI375)对表达载体进行切割后进行体外连接。二、表达载体的构建限制酶:BamHI目的基因通过人工接头添加酶切位点【苯基乙胺】兴奋剂【苯氨基丙酸】爱情【多巴胺】欣喜欢悦【后叶加压素】平静安定一、逆转录病毒感染法二、胚胎干细胞法三、显微注射法目的基因导入受体细胞逆转录病毒感染法优点:对于多细胞转化的优越性。例如:培育转基因家禽研究中有广泛应用，是目前制备转基因家禽最有效、最成功的方法。缺点:1.只能转移小片DNA(10kb)2.有潜在的致癌性胚胎干细胞法方法优点缺点显微注射法优点:1.导入的外源基因片段可长达50kp。2.无须载体缺点:难以控制整合率，检测必须等到子代出生。受精卵原核显微注射法是目前比较普遍最有成效的方法对象:小鼠、兔、猪、牛...目的基因的检测与表达【苯基乙胺】兴奋剂【苯氨基丙酸】爱情【多巴胺】欣喜欢悦【后叶加压素】平静安定一、原理及方法二、药物筛选转染细胞三、哺乳动物细胞表达系统一、原理及方法1.遗传学方法2.免疫学方法3.核酸杂交法4.PCR技术将外源基因导入后首先是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。包含三个步骤：1.筛选带有载体的克隆2.筛选带有重组基因的克隆3.筛选带有特异DNA序列的克隆二、药物筛选转染细胞选择性标记具有简便的显性遗传选择。现已发展许多选择性标记基因，这些标记基因编码某些酶，而这些酶能够破坏某种药物，从而达到筛选的目的。哺乳动物细胞最常用的选择性标记基因包括细菌新霉素抗性基因，编码氨基酸苷磷酸转移酶（APH），该酶可使氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）失活。如果将带有细菌新霉素抗性基因的质粒导入细胞，并在含有G-418的培养基中培养，未转染的细胞被杀死，而存活的细胞便是转染细胞。除G-418外，还有一些其他选择性标记可供选用。基因要在哺乳动物细胞内表达必须先将基因插入到适当的真核表达载体中。重组的表达载体在大肠杆菌中进行扩增，并从大肠杆菌中提取和纯化重组表达载体，然后将其导入受体细胞进行表达，在哺乳动物细胞中表达的基因可以是基因组DNA也可以是cDNA。三、哺乳动物细胞表达系统质粒载体DNA可以用磷酸钙沉淀法、电穿孔技术、DEAE-葡聚糖及脂质体介导等直接导入细胞。病毒载体DNA则须先导入包装细胞，获得假病毒颗粒后再用于感染受体细胞。三、哺乳动物细胞表达系统并不是每一个启动子在所有细胞中的表达效率都一样，所以，针对特定的靶细胞，先要选择合适的启动子。可通过检索文献找参考依据，如果找不到文献参考，可使用不同的启动子进行预试验。得到转染细胞后可继续加药培养，并逐渐加大药物浓度，即增加选择压力，这样可增加目的基因的拷贝数，提高表达效率。编码真核蛋白质的外源基因在真核细胞中表达时，表达产物对细胞本身的影响不大，蛋白质本身也很少被降解。因此真核表达载体的启动子大多是可以持续表达的，无需诱导。在筛选出转染细胞后，持续培养，便可在上清液中得到表达产物。Thankyou.