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细胞培养基本知识1细胞培养基本概念•细胞培养：从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。•细胞来源：细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，也可来自已经建立的细胞系或细胞株。•原代培养：是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖，直到占据所有可用基质(即：汇合)的培养阶段。•传代培养：在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。•细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。•细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中明确地选择出来，就成为一个细胞株。2•有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生，也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后，就成为连续细胞系。•培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(O2、CO2)，并可调节其物理化学环境(pH、渗透压、温度)。细胞培养基本概念3为什么要细胞培养？•避开机体自身调节和实验应激的整体因素的影响；•环境控制、均一性（可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结果）、经济、规模和机械化；4细胞培养的应用•细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生理和生化(例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发以及生物化合物(例如：疫苗、治疗性蛋白)的大规模生产。5细胞培养实验室一更二更一间二间三间走廊隔间准备室6细胞培养设备•基本设备：•细胞培养通风橱(即：层流通风橱或生物安全柜)•培养箱(推荐使用湿式二氧化碳培养箱)•水浴锅•离心机•冰箱和冰柜(–20°C)•细胞计数器(例如：Countess®自动细胞计数器或血球计数器)•倒置显微镜•液氮(N2)冷冻柜或冻存容器•灭菌器(即：高压灭菌器)•扩增设备：•抽吸泵(蠕动泵或真空泵)•pH计•共聚焦显微镜•流式细胞仪•其他用品：•细胞培养容器(例如：培养瓶、培养皿、滚瓶、多孔板)•吸管和移液器•注射器和针头•废物容器•培养基、血清和试剂•细胞系7•细胞培养通风橱通过维持工作区域上方稳定、单向的HEPA过滤空气流动，保护工作环境免受灰尘及其他空气污染物污染。•气流可以呈水平方向，与工作台面平行吹过，或者也可呈垂直方向，从通风橱上方吹向工作台面。8910111213141516准备与灭菌17灭菌方式的选择•热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃，1h；•热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅树脂、尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯用湿热灭菌：121℃，20min；•不耐热液体：过滤除菌；•不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。18灭菌方式的选择项目消毒方式玻璃器皿干热金属制品干热带螺口盖的玻璃品高压灭菌，将盖悬松玻璃移液管干热枪头高压灭菌离心管(5ml，15ml，50ml)高压灭菌，直立放置EP管(1.5ml，2ml，5ml，10ml)高压灭菌试管干热艾本德移液器（新）高压灭菌，整支高压灭菌过滤琼脂氨基酸蛋白胨抗生素EDTA牛血清白蛋白甘油胶原酶HEPES药物甲基纤维素谷氨酸盐酚红生长因子盐溶液HCL水NaHCO3NaOH血清丙酮酸钠胰蛋白酶19玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌•将玻璃和金属器皿放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon）的洗液中，侵泡过夜或至少2h（铝、铜制品不得浸泡）;•试管刷清洗，自来水冲洗4次，去离子水冲洗3次；•倒置于烘箱中烘干；•铝箔封口保存；•使用前24~48h，放入干热灭菌箱中，160℃灭菌1h，自然冷却后使用；•100目和600目的筛网需要超声清洗。20塑料制品的清洗和灭菌•将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon）的洗液中浸泡30min，自来水冲洗干净；•置于超声清洗器中清洗30min；•用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的刷子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）；•将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅中湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放置）；•自然冷却后置于烘箱中烘干。21水的制备和灭菌•细胞培养需要用超纯水（UPW）；•第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶体（总有机碳TOC≤10ug/L）；第三：去离子（电阻≥10MΩ/cm）；•高压灭菌121℃，20min，自然冷却。22PBS的制备•烧杯中加入1L灭菌超纯水；•放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min；•打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中；•搅拌至完全溶解；•PH计检测PH为7.4，变化＜0.1；•分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌；•自然冷却后盖紧，4℃或室温保存。23配置完全培养基•烧杯中加入1L灭菌超纯水，置于磁力搅拌器上，设定200r/min，边搅拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）；•用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下；•干粉溶解后加入2.438gNaHCO3，搅拌至完全溶解；•用HCl和NaOH调节PH为7.2，过滤除菌后（PH接近7.4）4℃保存；•商业胎牛血清一般是热灭活的，可以直接使用，如果需要过滤，先用0.22μm滤器过滤后，再用0.1μm滤器低压过滤才能保证无菌、无支原体。•双抗：称取氨苄青霉素0.625g，链霉素1g，PBS定容至100ml，4℃过夜，过滤除菌分装。•使用时如需配置200ml完全培养基，需加入180mlDMEM/F12，加入20ml胎牛血清，再加入2ml双抗即可。•使用时再加入血清的好处是DMEM/F12培养基可以4℃保存6~9个月，而加入血清后只能保存2~3周。24无菌操作技术25无菌操作技术•目的：在干净的培养物和含有微生物的外环境之间建立一个屏障，防止微生物的污染，细菌、支原体、酵母菌、真菌孢子等。•要求：与培养物直接接触的所有材料必须无菌（物品无菌），培养物和它的非灭菌环境之间不能有直接接触（环境无菌）。•要素：无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。26无菌工作区域——洁净台的使用•在一个十分干净的工作台上开始工作（什么都没有）；•用70%乙醇充分擦洗、紫外灭菌30min；•只把需要的物品（确保充分灭菌或用70%酒精擦拭）放入工作台内，洁净台不可用做储存区域；•将工作区的物品整理好（中央宽敞、容易拿取、拿取时不跨越物品、不遮挡层流）；•随时移走不再需要的物品；•要在视野范围内操作；•如有任何溢出物需随时擦去，并用70%乙醇擦洗；•实验完毕要移走洁净台里的所有物品（什么都没有），并用70%乙醇彻底擦洗工作面，然后紫外灭菌30min；27•在通风橱中部开阔区域放置细胞培养容器•移液器置于右前方易于取用的地方•试剂和培养基置于右后方，便于吸取•试管架置于中后部，用于固定其他试剂•小型容器置于左后部，用于盛放废液2829良好的个人卫生•洗手、戴上PE手套；•更换洁净服（长款）；•女生要将头发扎在身后；•戴上乳胶手套；•操作中经常进行手消毒（自动手消毒机）；•如进行有生物危险的实验时，需要P2实验室、生物安全柜、保证无裸露的皮肤。30外来试剂、培养基和培养物的无菌•商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保其无菌性，但其瓶子的外表面不是无菌的，新采购的试剂瓶子以及从冰箱或水浴槽中拿出来后，要用70%酒精擦拭灭菌再放入洁净台内。•自己配置的所有试剂、培养基和溶液必须采用适当的灭菌方法(例如：高压蒸汽、无菌过滤)进行灭菌。•引进的培养物（如购买的细胞系）是高危污染源，要先经过检疫，并坚持用不含抗生素的培养基培养直至证明没有污染。31细胞培养箱的无菌•培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。•培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。•培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。32细胞培养中的无菌操作•紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。•70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须用70%乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。•移液：使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸管应始终位于工作区域内。•一般移液操作用移液管和电动移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移液器，一次为多个器皿分装液体用注射器，只有灭菌的部分（移液管、枪头、注射器）可以伸进无菌容器内（储液瓶、细胞培养瓶），移液时避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘。33细胞培养中的无菌操作•加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋紧。•灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质，还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。•试剂瓶和培养瓶的操作：在洁净台内可以使试剂瓶口敞开直立，但不能让手或其他物品在开口的容器或无菌吸管的上方往来。•倒出液体：任何时候都不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养基和试剂。34小结•保持一个干净有调理的工作空间，并仅在需要的时候才在其中工作。•尽可能的预先准备好再开始操作，使培养物在培养箱外停留最短的时间，而且要做到各种操作快速、简便和顺利。•保持能看到操作面上的每样东西，时时警惕无菌面和非无菌面的偶然接触。•实验完毕后，保持工作区的干净整洁。35污染•化学污染：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂；•生物污染：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。细菌：通常被细菌污染的培养物呈云雾状(即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层薄膜。另外，经常还会发现培养基的pH值突然降低。在低倍显微镜下可见，细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的形状，有球状、杆状和螺旋状等。图为被大肠杆菌污染的293细胞36酵母：培养物被酵母污染后也会变得浑浊，但pH值变化极小，污染严重时pH值才会升高。在显微镜下，酵母呈单个卵圆形或球形颗粒，有些会芽生出较小的颗粒。图为293细胞被酵母污染。霉菌：是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。病毒：是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制。病毒体积极小，因而要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都十分困难。使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时。37•支原体：是一种没有细胞壁的简单细菌，被认为是能够自我复制的最小的生物。由于体积极小(一般小于1微米)，支原体的检测十分困难。可在培养物中持续存在造成慢性支原体感染，而不会导致细胞死亡，表现为：细胞增殖速度降低、饱和密度下降以及悬浮培养物凝集；MycoFluor支原体检测试剂盒：A固定细胞无污染，B固定细胞支原体污染，C活细胞支原体污染。38抗生素的使用•细胞培养时不应常规使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养基中去除，这种轻度污染最终将发展成大规模污染，而且连续使用抗生素还会掩盖支原体感染及其他隐性污染。•另外，有些抗生素会与细胞发生交叉反应，干扰