SDS-CTAB改进方法提取细菌基因组DNA

参考《分子微生物生态学手册2004年第二版》由德国国家生物技术研究中心所撰丁雄（Seandung）编译1改进SDS-CTAB方法提取细菌基因组DNA（经济型实验室专用，可修改适合特定菌种）具体步骤：（1）将待检测菌株接种于3mLLB或BHI培养基中，37℃培养过夜；注：以生长至对数期的细菌为最佳提取对象，因为过对数期时培养基中会积聚过度的核酸酶降解DNA。（2）取1.5mL上述菌液于2mL离心管，10,000~15,000rpm，离心10~15min，去上清（若所得菌体过少可重复此步骤一次）；注：对于接种于琼脂培养基的细菌，应先对其进行预处理以洗掉琼脂然后再离心，而且考虑到革兰氏阴性菌一碰到此类螯合剂就会发生细胞溶解，因此所用细菌洗涤液中不得含有EDTA。离心倒去上清液后，可用纸巾擦拭管壁边缘残留液体。离心后菌体的湿重最好为0.1g左右。附（细菌洗涤液配方）：0.4MNaCI,50mMTris-HCI(pH8.0),50mMMgS04,用无菌去离子水配制。（3）加入564µLTE缓冲液（pH8.0）重悬菌体（可使用无菌牙签充分混合菌体使其完全重悬）。注：对于革兰氏阳性菌，此步中细胞悬液还得加入约10µg的溶菌酶（结晶状最佳），此时不得涡旋！上下颠倒离心管几次使其混合均匀，然后37℃放置10~60min。!溶菌酶必须在蛋白酶K和SDS之前!（4）加入30µL10%~20%SDS和6µL蛋白酶K（10mg/mL），混合均匀、不得涡旋，置于37℃（可用金属浴）条件反应1~2h，使悬液相对清澈有粘性为止。（5）加入100µL5MNaCl，混合均匀、不得涡旋，65℃反应2min。然后，加入80µLCTAB/NaCl，混合均匀、不得涡旋，65℃反应10min。注：在加入CTAB/NaCl之前,必须用5MNaCl充分混匀裂解产物，且CTAB/NaCl溶液加之前得先预热至65℃，并且吸取时移液器枪头应去除尖端。（6）加入等体积（约800µL）氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀，10,000rpm离心5min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液A）至新的2mL离心管中。（7）加入等体积（约800µL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）于上清液A中，充分混匀，15,000rpm离心5min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液B）至新的2mL离心管中。（8）加入等体积（约800µL）氯仿/异戊醇（24:1）于上清液B中，充分混匀，10,000rpm离心5min。离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液C）至新的2mL离心管中。参考《分子微生物生态学手册2004年第二版》由德国国家生物技术研究中心所撰丁雄（Seandung）编译2（9）加入0.7倍体积（约560µL）异丙醇至上清液C以沉淀DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为DNA。常温静置5~60min后，12,000~15,000rpm常温离心15~30min。可见DNA团集于离心管壁边上。然后小心去除异丙醇，避免碰到DNA团。（10）加入500µL70%乙醇后上下颠倒离心管几次以洗涤DNA团，再常温12,000~15,000rpm离心15~30min。小心除去乙醇，并用纸巾擦拭管壁边缘多余液体。（11）放置含DNA离心管于通风橱处风干，时间不得超过5min。然后加入50~100µLTE缓冲液重悬DNA，可放置37℃下使DNA重悬完全。注：此时可通过测定OD260nm来估算DNA的浓度，且对于双链DNA其OD=1就相当于50Mg/mL。DNA的纯度可通过测定A260/A280比值来估算。DNA的大小可用0.5%或0.8%琼脂糖凝胶电泳来判断。如有约20kb长的无拖带DNA成像则表明提取的DNA没有断裂，而被核酸酶降解或剪切的DNA表现出拖带现象和小分子重量。（12）用TE缓冲液调整DNA终浓度至1~10µg/µL，然后-20°C长期保存，也可整数倍分装多管用于PCR。注：13-17为DNA纯化用（13）加入TE（pH8.0）至200µL，加入20µgRNaseA，37℃，反应30min。（14）再加入400µLTE（pH8.0）和等体积（600µL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），充分混匀，12000rmp，离心5min。（15）小心移取上清至新的无菌2mL离心管中，加入1/10体积（50µL）的3MNaOAc（pH6.0）和2倍体积（1mL）的冰冻无水乙醇，混匀，-20℃放置超过30min。（16）12000rmp，4℃离心，10min，去上清；加入冰冻70%乙醇洗涤沉淀，12000rmp，4℃离心，10min，去上清。（17）沉淀置通风橱处风干后，加入适量TE（pH8.0）或者无菌水溶解，置-20℃存放；参考《分子微生物生态学手册2004年第二版》由德国国家生物技术研究中心所撰丁雄（Seandung）编译3溶液配制：(1)LB液体培养基（1000mL）按要求称取下列药品：酵母提取物，5g胰蛋白胨，10gNaCl，10g加入800mL蒸馏水溶解，用10MNaOH调节pH至7.0，蒸馏水定容至1000mL，按需要分装；121℃高压下蒸汽灭菌20min（高压灭菌条件下同）；4℃保存备用。(2)LB琼脂培养基（1000mL）配方同LB液体培养基，调节pH至7.0后，加入15g琼脂粉，蒸馏水定容到1000mL，高压灭菌；趁热倾倒平板，4℃保存备用。(3)20×TE缓冲液（500mL）按要求称取下列药品：Tris碱，12.1gEDTA，3.7g加入400mL蒸馏水溶解，用浓盐酸调节pH值至8.0，蒸馏水定容至500mL，室温贮存备用。(4)1×TE缓冲液用蒸馏水将上述贮存液稀释20倍，高压灭菌，室温保存备用。(5)3MNaAc（pH5.2,500mL）称取NaAc·3H2O204.1g，400mL蒸馏水中溶解，用冰乙酸调节pH值至5.2，定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。(6)10%SDS（500mL）称取SDS50g，于400mL蒸馏水中溶解，必要时可加热并搅拌溶解，加水定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。参考《分子微生物生态学手册2004年第二版》由德国国家生物技术研究中心所撰丁雄（Seandung）编译4(7)5MNaCl（500mL）称取NaCl146g，加入400mL蒸馏水溶解，定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。(8)CTAB/NaCl溶液（500mL）按要求称取下列药品：NaCl，20.4gCTAB，50g用400mL蒸馏水溶解，必要时可加热并搅拌溶解，定容至500mL，高压灭菌，室温贮存备用。(9)氯仿/异戊醇（24:1,500mL）分别量取氯仿480mL，异戊醇20mL，混合均匀，避光，4℃贮存备用。(10)苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）分别量取等体积的氯仿/异戊醇（24:1）和Tris饱和酚，混合均匀，避光，4℃贮存备用，建议现配现用。(11)50×TAE缓冲液按要求称取下列药品：Tris碱，242gNa2EDTA·2H2O，37.2g800mL蒸馏水溶解，加入冰乙酸57.1mL，混匀，加水定容至1000mL，室温贮存备用。1×TAE缓冲液（将上述贮存液用蒸馏水稀释50倍，室温贮存备用）(12)0.1%溴化乙锭称取0.1g溴化乙锭，加入100mL蒸馏水，混匀，避光，室温贮存。(13)无菌水取去离子超纯水，高压灭菌，贮存备用。