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一。免疫印迹法免疫印迹法（immunoblottingtest，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzymelinkedimmunoelectrotransferblot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southenblot相类似，亦被称为Westernblot。免疫印迹（westernblotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。图1免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。二．蛋白质的电泳分离一、样本的制备几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白质样品。例如，不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等。免疫印迹还可分析各种组织、器官或微生物等来源的粗制样品。用于免疫印迹的样本种类繁多，处理的方法也有所不同，为了选择理想的处理方法，应当考虑细胞的类型和待测抗原的性质。(一)细菌表达蛋白质和样本制备一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解，具体方法如下：[试剂与设备]（1）表达待检测蛋白质的细菌。（2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。（3）2xSDS凝胶加样缓冲液：100mmol／LTris—HCl（pH6.8）200mmol／L二硫苏糖醇（DTT）4％SDS（电泳级）0.2％溴酚蓝20％甘油不含有二硫苏糖醇（DTT）的2XSDS凝胶加样缓冲液可保存于室温，临用前须从lmol／L二硫苏糖醇储存液现用现加于上述缓冲液中。（4）台式离心机。（5）超声破碎仪。（6）水浴箱。（7）涡漩振荡器。（8）加样器与吸头等。[操作步骤]（1）表达靶蛋白大肠杆菌经诱导适当时间后，用微量离心机以12000g离心30s，收集lml培养的菌体。（2）吸取培养液，加入0.5ml用冰预冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振荡沉淀的菌体，使之复悬，用微量离心机于0°C以12000g离心30s回收菌体。（3）再次吸出上清液，小心地吸净管壁上的液滴，尽可能使沉淀物不带有残留液体。（4）加入25μl水，振荡使沉淀复悬，一旦菌体分散开来，立即加入25μl2XSDS凝胶加样缓冲液，继续振荡20s。（5）样品在沸水浴中放置5min。（6）采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切，根据所用超声处理仪的输出功率及其设定状态，以最大功率处理0.5—2min应能有效地将裂解液粘度降至可控水平；（7）样品于室温以12000g离心10min，将上清液移至另一管中，弃沉淀物；（8）吸取经剪切或超声处理的样品25μl电泳，剩余样品保存于—20~C备用。(二)快速裂解酵母细胞制备样本使用这种方法会使蛋白质变性，在所用抗体能识别变性靶蛋白时才能使用这一方法。[试剂与设备]（1）待检测的酵母菌。（2）25％三氯乙酸（TCA）（3）1％SDS。（4）丙酮。（5）RIPA缓冲液：50mmol／LTris—HCl（pH7.5）150mmol／LNaCl1％NonidetP-40（NP-40）0.5％去氧胆酸钠0.1％SDS（6）玻璃珠（直径0.45—0.50mm）。（7）台式离心机。（8）水浴箱。（9）涡漩振荡器。（10）加样器与吸头等。[操作步骤]（1）0°C以12000g离心lmin，从lml培养物中收集细胞，弃上清液（当靶细胞为分泌型蛋白时除外）。（2）用0．5ml25％三氯乙酸（TCA）重悬细胞。（3）按步骤1离心回收细胞，重悬于1ml90％丙酮中。（4）按步骤（1）离心，估算沉淀物体积，加入等体积1％SDS重新悬浮沉淀物。（5）加入经酸处理的玻璃珠（直径0．45—0．50mm）至溶液的弯月面处。（6）振荡悬液5次，每次间歇期间将悬液置于冰浴中冷却lmin，在相差显微镜下监测细胞（7）用一烧红的皮下注射器针头（23号）在微量离心管的顶盖上穿一小洞，以防加热过程中玻璃球冲出离心管。（8）在沸水浴中加热3min。（9）把玻璃珠转移到另一个微量离心管中，用0.5mlRIPA缓冲液洗涤原离心管，并把洗液合并于内装玻璃珠的管中。（10）在微量离心管底部打一小洞，回收细胞提取液，这一操作使用烧红的皮下注射器针头效果最佳。把仍装载玻璃球的微量离心管置于另一空微量离心管上，把如此重叠的一对微量离心管，于4°C以2000g离心2min。（11）回收下面一只内有细胞提取液的微量离心管，于4°C12以2000g离心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一个微量离心管中，—20°C贮存备用。[注意事项]酵母细胞提取液储存于—20°C一般是稳定的，但是，如果待测蛋白被水解，则应在提取液中加入蛋白酶抑制剂，并保存于0°C。(三)哺乳动物细胞和组织的样本制备哺乳动物细胞和组织有单层培养细胞、悬浮培养细胞和组织碎片，虽然均可采用凝胶加样缓冲液裂解的方法来制备样本，但制备方法有所差异。1．对单层细胞的处理方法[试剂与设备]（1）磷酸缓冲盐溶液（PBS）。（2）1XSDS凝胶加样缓冲液（参见上述“细菌表达蛋白质和样本制备”）。（3）水浴箱。（4）吸管、细胞刮棒等。[操作步骤]（1）用磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗细胞2次，弃去洗液并吸净残余的PBS液体。（2）如直径为90mm的平皿，则加人100-200μl加热到85°C的1XSDS凝胶加样缓冲液溶解细胞，用细胞刮棒把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中。2．对悬浮培养细胞和组织碎片的处理方法。[试剂与设备]（1）悬浮缓冲液的配制：0.1mol／LNaCl0.01mol／LTris—IICI（pH7．6）0.001mol／LEDTA（pH8．0）lμl／mlAprotinin100μg／ml苯甲基磺酰氟（PMSF）（2）2XSDS凝胶加样缓冲液（参见上述“细菌表达蛋白质和样本制备”）。（3）台式离心机。（4）吸管或真空抽吸装置。（5）加样器和吸头等。[操作步骤]（1）取1s组织或109细胞，加lml冰预冷的悬浮缓冲液分散细胞或组织碎片（把细胞悬浮于上述缓冲液是为了防止加入2XSDS凝胶加样缓冲液时形成不溶性团块，这一步应使用冰预冷的悬浮缓冲液而且操作应尽可能迅速，以减少蛋白质降解。大多数哺乳动物组织可以在悬浮缓冲液液面之下迅速用镊子分开或用剪刀剪碎。）（2）于4°C以3000g离心5min，估算离心管底部沉淀物的体积。（3）吸出上清液，用连接于抽真空装置的一次性使用吸头把管壁上的液滴吸净。（4）尽快加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液。[注意事项]PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸人、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之，凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH的升高而加快，且25°C的失活速率高于4°C。pH值为8.0时，20μmol／L的PMSF水溶液的半寿期大约为35min，PMSF通常配成10mmol／L或100mmoL／L浓度的贮存液（1.74或17.4mg／ml溶于异丙醇中）保存于—20℃。(四)免疫沉淀蛋白的样本制备一般情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在免疫印迹之前，使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是含量极稀少蛋白的检测，由于适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原，此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白；二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用，此时，用于免疫沉淀的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质，如果清楚该复合物的性质，并知道应该使用何种抗体时，这种方法就非常有用，为研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用提供了一种有效的方法。[试剂与设备]（1）样品缓冲液。Tris／GlyeineSDS—PAGE样品缓冲液是：2％SDS，100mmol／LDTT（取自—20°C存放的lmoL／L贮存液，临用前加入），60mmol／LTris（pH6.8），0.01％溴酚蓝和10％甘油。（2）水浴箱。（3）加样器和吸头等。[操作步骤]（1）将样品缓冲液加人吸附有抗原和抗体，并经过洗涤的A蛋白或C蛋白微珠中。使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为2：1—5：1左右更好，但一般不超过10：1.（2）样品置70°C水浴加热至少5min。除特殊情况外，在凝胶内加样之前不必去除微珠。（3）样品既可立即使用也可冻存。—20°C存放的样品可稳定保存数月。[注意事项]（1）对照设置：实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样品。通过两者比较可以鉴别抗体所形成的特异性条带和非特异性条带（例如，来自于重链的条带）。此外还应该包括含有已知的或标准量的待测抗原的阳性样品，阳性对照可以是含有已知或标准量待测抗原的任何样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或来源于已充分鉴定的细胞系。该样品不必经过免疫沉淀但应在临近的胶道和其他样品同时上样电泳。这样能够提示免疫印迹是否成功，并对抗原的相对分子量进行精确比较。如果阳性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计待测样品中抗原的含量。（2）常见问题与解决方法：有一个值得注意的问题，将免疫沉淀制备的蛋白用于免疫印迹时，来自免疫沉淀的抗体会出现在印迹膜上。该抗体可被二抗试剂检出。通常抗体重链和轻链的大小并不干扰待测抗原的鉴定。然而，若待测抗原的大小在50kD或25kD左右（大约为重链和轻链多肽的大小），则难以对待测抗原进行鉴定。出现这种情况，有两种解决办法：一是可将免疫沉淀抗体共价结合在A蛋白或C蛋白微珠上；其二是采用直接检测技术进行测定。二．蛋白质凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE），是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板，见图2.SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。图2SDS-PAGE凝胶分层示意图待分离蛋白质样品在电