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第七章微生物的生长和遗传变异第一节微生物的生长及其特性一、微生物生长繁殖的概念?1.生长、繁殖?生长：微生物细胞的增长。（个体体积的增加）?（单细胞、多细胞）?繁殖：微生物个体数目的增加。个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程?群体生长：个体的进一步生长，就引起了群体的生长；群体的生长可以用重量、体积、个体浓度或密度指标来测定。?群体生长＝个体生长+个体繁殖?一般微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义，所以通常讲的“生长”是指群体生长。这一点与研究大生物时有所不同。?（1）概念?两次细胞分裂的时间间隔，称为世代时间。?（2）影响?世代时间受培养环境的影响。?不同的微生物，生长繁殖速度不同，世代时间也有不同。2.世代时间注意与生长繁殖的区别二、微生物生长的测定方法（一）、计数法显微镜直接计数法荧光染色计数法活菌计数法特定微生物计数法涂片染色法计数器测定法比例计数法平板计数法液体计数法薄膜计数法电子计数器计数测含氮量测含碳量重量法光密度法（OD）元素法细胞物质含量法其他生理指标法蛋白质DNARNA生物醌二、测生长量法显微镜直接计数法?显微镜直接计数法又称全数法，是常用的微生物生长测定方法，其特点是测定过程快速，但不能区分微生物的死活。涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数×涂布面积/视野面积×100×稀释倍数使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。优点：操作简便，计数直观。缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察计数器计数法比例计数法?将待测样品溶液与等体积的血液（或其他参照）混合，然后涂片，在显微镜下测定微生物与红血球数的比例，因血液中的红血球数已知(男性400—500万个／mL，女性350-450万个／mL)，由此可以测得微生物数量。?荧光染色计数法?DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole，4，6-二脒基—2—苯基吲哚)、DTAF（5-(4，6-Dichloro-1，3，5-triazin-2-y1）aminofluoreseein，二氯三嗪基氨基荧光素]都是常用的无毒性荧光染料，能够与DNA双链强力结合并产生荧光。DAPI染色计数法是利用DAPI染料与微生物的DNA结合产生荧光，从而在荧光显微镜下进行微生物计数的方法。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于细胞的染色。DAPI与双链DNA结合时，主要结合在DNA的A-T碱基区，产生的荧光基团的吸收峰是358nm，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。?DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)或TexasRed染剂(红色荧光染剂)的发射波长，仅有少部分重叠，因此可以利用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。DAPI/DTAF染色计数法具有专一性强、灵敏度高、稳定性好、使用方便等特点。此外，荧光染色法还可以与流式细胞计数仪联合使用以便更快速、准确地处理大量的微生物样本，如细胞分类计数等。活菌计数法?活菌计数法又称间接计数法，是通过测定样品中活的微生物数量来间接地表示微生物的数量。因此，这种方法不含死的微生物细胞，而且测定所需的时间也较长。常用的有平板计数法、液体计数法和薄膜计数法。平板计数法（稀释平板计数法）?对样品进行适当稀释→单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖→肉眼可见的菌落→对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数?传统计数方法。对设备要求不高。10-310-510-410-6平板菌落计数法最常用的活菌计数法。将适当稀释的菌液倾注平板或涂布在平板表面，经保温培养后，以平板上出现的菌落数乘以稀释度就可以计算出原菌液的含菌量。直径9cm的培养皿平板上出现菌落数一般以50~500为宜。按照国家标准规定的样品菌落总数测定的计数原则，以平板菌落数在30~300之间为报告依据。9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml×2×2×2平板菌落计数法★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15~20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；★适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物，★误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作?涂布平板法?使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！（一般0.2ml）同一稀释度三个以上重复,取平均值；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；样品充分混匀；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；要求：每ml活菌数＝同一稀释度平均数×稀释倍数×5注意：要三个以上重复平板平均计数；不适合丝状菌稀释液体计数法又称MPN（MostProbableNumber）法或最可能数法?特点：液体培养、统计学查表计数?例如测定水中大肠菌群的数量?方法：菌样巧妙稀释、稀释接种、样品培养、统计－查表－计算?①统计出数量指标?②查表表——MPN表（P449）?③计算?水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。液体稀释法对样品做10倍连续稀释，从适宜的3个连续稀释度中各取5ml试样，接种3组共9支装有培养液的试管中（每管接入1ml）。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查M.P.N.表（mostprobablenumber，最大可能数），根据样品稀释倍数就可计算处其中的活菌含量。9ml9ml9ml9ml1ml1ml1ml×3×3×31ml1ml1ml1ml薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。滤膜计数法荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization）（FISH）?FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。?FISH大名鼎鼎（fluorescenceinsituhybridization）。是钓鱼用具，鱼就是染色体上的DNA序列。前提是必须知道这个序列的编码顺序，因为知道顺序才能够制作鱼饵。荧光用来显示鱼的情况（位置，量）。?钓鱼要准备这些东西：1、上哪钓鱼——固定生物样本并准备显微镜涂片。?2、特殊眼镜——预先调节显微镜。?3、定位工具——标记探针。?4、诱敌深入——对目标DNA进行变性。?5、钓鱼——进行原位杂交和杂交后洗涤。?6、看鱼之前——免疫细胞化学染色。?7、看鱼——显微镜观察。干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得10~90mg干重的细胞。比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。生理指标法?测含氮量蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。?其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。?1培养方法?分批培养：一定的环境下，微生物在一个有液体培养基的容器内生长繁殖。?连续培养：流入新鲜培养基的同时不断流出培养物的培养方式。三、微生物的生长特性（群体生长）典型生长曲线(P122)：将菌种接种在液体培养基中隔一定时间取样，计算菌数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图。?包括延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期。典型生长曲线，只适用于单细胞微生物如细菌和酵母菌，对于丝状生长的真菌或放线菌,还有活性污泥，则只能按微生物的重量绘制生长曲线——只能获得非典型的生长曲线.2、分批培养微生物的生长规律加速期减速期（1）延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。特点：①生长速率常数等于零。②细胞形态变大或增长③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。④合成代谢活跃。⑤对外界不良条件反应敏感。如何知道处于对数期影响延滞期长短的因素：①接种龄接种龄即“种子”的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。实验证明，如果以对数期接种龄的“种子”接种，则子代培养物的延滞期就短。②接种量接种量的大小明显影响延滞期的长短。（基数大）③培养基成分接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到营养单调的组合培养基中的延滞期短。（2）指数期又称对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。特点：①生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的代时G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；②细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；③酶系活跃，代谢旺盛。指数期的微生物可作为代谢、生理等研究的良好材料，是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。?繁殖代数n：x2=x1·2n以对数表示：lgx2=lgx1+nlg2?生长速率常数R?世代时间G指数生长期的三个参数（3）稳定期又称静止期或最高生长期。?特点：?细胞数目不增加(R=0)，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。?菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系?细胞长、大?代谢旺盛(RNA含量增加)?诱导酶迅速合成?对不良条件敏感，抵抗力降低?稳定期到来的原因主要是：①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；③有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜，等等。在稳定期时，细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。?应用稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物的最佳收获期，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。注意三条曲线：生长曲线、底物消耗曲线、代谢产物合成曲线。（4）衰亡期?特点：