蔗糖酶的提取

实验报告课程名称：生物化学实验（丙）指导老师：成绩：__________________实验名称：蔗糖酶的提取实验类型：同组学生姓名：一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一．实验目的和要求学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。二．实验内容和原理1.蔗糖酶简介：蔗糖酶为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。酵母蔗糖酶的分子量约为270000D（因来源不同，分子量也存在差异）。本实验中所用酵母蔗糖酶的PI约为4.8，最适pH为4.6.耐酸和热，最适温度50C。耐乙醇，在47.5%的乙醇溶液中能够沉淀且活性保持，因此可用乙醇纯化法进行分离提纯。2.酵母蔗糖酶的制备原理上层：脂溶性物质（本实验用的提取液关系，本层不明显）酵母缓冲液、石英砂破细离心细胞研磨胞中层（水层）：蔗糖酶、可溶性杂质等下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等上清：蔗糖酶、可溶性杂质（如糖类、代谢中间取中层50℃水浴中使热不稳定离心物、RNA、DNA和未变性的酶和蛋白质）等（水层）保温30min蛋白变性沉淀：变性蛋白上清：杂蛋白及可溶性杂质等加入等体积95%乙醇使蔗糖酶离心取上清沉淀冰浴20min沉淀：蔗糖酶、杂蛋白（已变性或者与蔗糖酶在乙醇中行为一样的酶）等专业：姓名：学号：日期：2013年5月7日地点：生物实验大楼310室装订线3.本实验中由于蔗糖酶位于酵母细胞内，所以需要先将细胞破碎，将蔗糖酶从细胞中提取出来。细胞破碎常用的方法如下图所示：本实验采取研磨的方法，通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎。三．实验材料与试剂市售干酵母粉，石英砂，95%乙醇（-20℃），20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液四．实验器材与仪器电子天平，研钵，50ml高速离心管，托盘天平，高速冷冻离心机，恒温水温箱，制冰机，1.5ml离心管，-20℃冰箱五．操作方法与实验步骤1.酵母细胞破碎：称取市售干酵母粉8g（需准确称量，记录准确质量m），称取约2.5g石英砂，放入研钵中，直接研磨至尽可能成细粉末状（约5分钟，研磨需用力）。量取25ml20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液，分4次加入研钵中研磨20分钟（每次加入5ml，最后的用于洗研钵。前两次加入后比较粘稠，可以多研磨一下），使呈糊状液体。将糊状液体转移到50ml离心管中，与另一组离心管平衡后，4℃、12000r/min离心10min，收集上清液并用量筒量出体积V1（样品Ⅰ）；另留0.5ml上清液（样品Ⅱ）于-20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。【判断离心管平衡：两组的离心管加入液体后连同盖子一起放置在以调平衡的托盘天平上，因为离心结束后需要的为上清液，故在天平上质量较轻的一端加入石英砂，直至二者平衡。最后放入离心机时，两质量一致的离心管需放在对称位子。】2.热处理将上一步抽提液（样品Ⅰ）倒入50ml离心管中，迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟。期间每隔7-8mim需摇晃一下离心管。保温后迅速用冰浴冷却3min，擦干后，如上一步一样调平衡，平衡后，4℃、12000r/min离心10min，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅲ），留0.5ml（样品Ⅳ）放置在-20℃冰箱中保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析。3.有机溶剂（乙醇）沉淀将上一步上清液倒入50ml离心管中，加入相同体积（V2-0.5ml）的-20℃95%的乙醇，乙醇的加入需要将离心管放置在冰浴中同时用滴管缓慢向其中滴加乙醇，边加边用玻璃棒进行搅拌，注意控制在8min左右加完。混匀之后，在冰浴之中放置20min，用纸巾擦去离心管表面的水渍，与另一只离心管平衡之后4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液。【由于此次需要的是沉淀部分，故离心管的平衡不能够用加石英砂的方法，所以每组需另外取一只离心管，向其中加入水，与实验管进行平衡】沉淀用8-10ml20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液溶解后，放置5min，将离心管放入-20℃冰箱保存，以用于离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶。六．实验数据的记录与处理原始数据记录：称取的市售干酵母粉m=8.02g第一次离心后上清液体积V1=10.0ml第二次离心后上清液体积V2=7.5ml七．实验结果与分析实验每次测得的体积可能存在误差，可能原因如下：1.研磨过程中，有些颗粒物质弹出研钵2.研磨不充分，未使所有蔗糖酶都进入溶液中3.从研钵中将液体倒入离心管中时，研钵、玻璃棒上面沾有的物质无法用有限的缓冲液洗干净4.仪器间倾倒上清液的时候可能有部分洒出，或者上清液无法完全吸取干净5.50℃下，除了蔗糖酶，可能有其他酶未完全失活，仍留在上清液中6.用有机溶剂（乙醇）沉淀蔗糖酶时，可能有其他与蔗糖酶在乙醇中行为相似的酶或者已经变性的蛋白质也存在于沉淀中，导致误差。八．实验讨论与心得1.本实验在干酵母中提取和分离纯化蔗糖酶的过程中运用到了细胞破碎技术和离心技术。也可利用酶溶法破碎细胞，该方法利用各种水解酶将细胞壁破碎，释放内容物，适用多种微生物。2.细胞破碎的各种方法中，固体剪切法（研磨法）简单易行，而且干磨法比湿磨法所得到的的蔗糖酶的产率要更高一些，故本实验中选用干磨法。3.本实验在对蔗糖酶进行初步纯化时两次蛋白质的沉淀原理是不一样的，第一次蛋白质在高温下失活，第二次是在有机溶剂中沉淀，蛋白质保持原有的构型和活性，因为蔗糖酶比较耐高温，可以在50℃保持活性，因此蔗糖酶在纯化过程中不会有太大的损失。但是在离心过程中为了尽可能保持蔗糖酶的活性还是要在低温中进行。4.在进行离心操作之前，一定要先对两只离心管进行平衡，避免离心过程中离心机身产生振动而损坏离心机。（在达到最大转速之前人必须在离心机旁确认在转速稳定时离心机没有发出较大的噪音）