RNAi-技术介绍

RNAINTERFERENCE生命学院609首次发现双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)能够导致基因沉默的现象来源于对线虫的研究。1995年,康乃尔大学的Guo和Kempheus尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能,结果发现反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达。但奇怪的是，注入作为对照的正义链RNA，也同样阻断了该基因的表达。这个奇怪现象的谜底直到1998年才被解开。AFire和sxu等首次将dsRNA——正义链和反义链的混合物注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强的多的基因沉默(genesilencing)。他们将这种现象称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)。Nature.1998Feb19;391这是谁？AndrewFireCraigMelloRNA干扰的定义RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是通过RNA定位特异性的沉默某些基因的生理过程。经mRNA的降解导致基因的沉默。Nature.2001Jan18;409RNAi中的小分子主要包括：miRNA,siRNA,dsRNA,shRNA•miRNA：单链约22bp片段，一般由基因组DNA编码；•siRNA:20~25bp双链RNA分子，一般由外源直接注入的dsRNA（或经质粒等载体携带）；•shRNA：发卡RNA，常用于构入载体的基因沉默；•dsRNA:双链RNA，可引起真核生物的干扰素反应。相同点/联系点siRNAmiRNA长度及特征都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3＇端是羟基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的Dicer酶依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白参与RISC组分二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了ontarget和offtarget的问题作用方式都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用进化关系可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA不同点/分歧点siRNAmiRNA机制性质往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况是生物体自身的一套正常的调控机制直接来源长链dsRNA发夹状pre-miRNA分子结构siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UUmiRNA是单链RNA对靶RNA特异性较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变相对较低，一个突变不影响miRNA的效应作用方式RNAi途径miRNA途径生物合成，成熟过程由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的PrecursormiRNAs(pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中Argonaute(AGO)蛋白质各有不同的AGO蛋白质各有不同的AGO蛋白质互补性（complementarity）一般要求完全互补不完全互补，存在错配现象各自的生物学功能不同ⅰ抵抗病毒的防御机制；ⅱ沉默那些过分表达的mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子的破坏对有机体的生长发育有重要作用重要特性高度特异性高度的保守性、时序性和组织特异性作用机制单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译（offtarget）。成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。加工过程siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解。对RNA的影响降解目标mRNA；影响mRNA的稳定性在RNA代谢的各个层面进行调控；与mRNA的稳定性无关作用位置siRNA可作用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶标基因3´-UTR区生物学意义siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达RNAIMECHANISM第一步:I.双链长RNA运送至胞质（Longdouble-strandedRNA,dsRNA）II.Dicer将dsRNA切割成约22bp的片段。第二步:I.形成依赖RNA的沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplexes,RISC）II.siRNA引导RISC识别目的RNAIII.RISC降解目的RNAAdvDrugDelivRev.2013;65:391.详细步骤dsRNA的切割•内源的MicroRNA前体由基因组中的RNA编码区域转录而来，形成茎环结构后运至胞质中。胞质中的Dicer蛋白将MicroRNA切割在约20~25bp的短片段。•Dicer将dsRNA切割形成约25bp大小的RNA片段，为形成RISC提供基础。MicroRNA形成过程Science.2006Jan13;311详细步骤dsRNA的切割•外源性的dsRNA与特定的作用蛋白（比如果蝇中的R2D2）结合，并激活Dicer的活性。•这个作用蛋白仅与长链dsRNA结合，并促进RNA的切割以及形成RISC复合物的过程。MiRNA＆siRNAmiRNA是由机体内源的RNA经修饰切剪而成，由基因组中的某些基因转录，这些miRNA主要是为了调节蛋白表达，在生物发育过程中具有非常重要的作用。siRNA(SmallinterferingRNA)由长链的外源dsRNA经剪切得来。区别：siRNA与目的RNA的绝对严格匹配，沉默单个目的基因；miRNA与目的基因则不需要完全配对，可能影响多个有相同序列的基因。联系：两者都是通过RISC导致基因沉默。RISC复合物切割RICS复合物具有核酸内切酶活性，可以通过复合物中的RNA靶定至目的RNA，利用内切酶活性切割目的RNA，实现基因沉默。古生菌中RISC复合物中argonaute(RISC中具有酶活性的部分)的结构示意图Nature.2009Jan22;457利用shRNA通过实现哺乳动物细胞中基因沉默siRNA的设计1.21-23个碱基,GC含量小于50%2.与目的RNA绝对配对，并且不与其他RNA产生配对反应。3.siRNA最好定位在基因的3’的调控序列Targeting3’UTRworksbetterthan5’UTR4.TargetmRNAregionisopenin2ndstructure5.Have1-2nt3’U(T)overhang(mRNAtargetstartingwithAA)--------------------UUUU--------------------6.Addmultiple(4)siRNAtogetherRNA沉默的应用GeneknockdownRNA沉默最常见的是在细胞或模式动物器官水平上研究基因的功能。RNA沉默并不能完全抑制基因的表达，所以这个技术叫做knockdown，而不是knockout功能基因组线虫和果蝇是用RNA沉默技术研究功能基因组最常用的模式动物，在这两种模式动物中RNA沉默较为有效。RNA沉默技术的成熟模式动物：果蝇PlosGenet2006Jul;2(7):MedicineRNAi沉默技术在医学和药物研发中具有很广阔的前景。经RNA沉默技术培养的线虫，沉默细胞核激素受体导致脱氢酶量的变化。