RNAi的原理和应用

RNAi的原理和应用摘要：RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。在内切核酸酶(一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶，称为Dicer.)作用下加工裂解形成21～25nt（核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA,即siRNA。果蝇中RNaseIII样核酸酶Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域.已发现在哺乳动物中也存在Dicer同类物。siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC。关键词：RNA干扰siRNAmiRNA抑制机制PrincipleandapplicationofRNAiWangChunrongSichuanNormalUniversity.Abstract:RNAinterference(RNAinterference,RNAi)isadefensemechanismofevolutionaryconservedagainsttransgenicoralienvirusinvasion.Theendonuclease(onewithRNaseⅢlikeactivityofnuclease,referredtoasDicer.)processingfractureformedundertheactionof21~25NT(nucleotide)composedofsenseandantisensesequencesofsmallinterferingdsRNA,namelysiRNA.RNaseIIIlikenucleicacidenzymeDicerinDrosophilacontainshelicase(helicase)activityanddsRNAbindingdomainandPAZdomain.HavebeenfoundinmammalsthereareDiceranalogues.SiRNAandspecificenzymecombinedwiththeformationofRNAinducedsilencingcomplexRISC.Keywords:siRNAmiRNARNAinterferencesuppressionmechanism目录第一章对RNA干扰的基本认识………………………………………………………11.1RNA干扰提要………………………………………………………11.2RNA干扰的发现…………………………………………………………………………….1第二章作用机制………………………………………………………………………………22.1RNA干扰的作用机制…………………………………….........................22.2RNA干扰的分子抑制机制…………………………………………………32.2.1转录抑制…………………………………………………………………………………..32.2.2转录后抑制……………………………………………………………………….………32.2.3翻译抑制…………………………………………………………………………………..3第三章RNA干扰的作用…………………………………………………………….4第四章RNA干扰的应用…………………………………………………………….4参考文献…………………………………………………………………………………….6致谢………………………………………………………………..…………………………6前言：RNA干扰（RNAinterference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemicRNAi)[2][3]。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。正文：第一章对RNA干扰的基本认识1.1RNA干扰提要RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制(posttranscriptionalgenesiliencing,PTGS)范畴。RNAi广泛存在于生物界,从低等原核生物,到植物,真菌,无脊椎动物,甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象,只是机制也更为复杂。RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术通过双链RNA的介导，可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。在肿瘤研究中，通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。癌基因的激活认为是肿瘤发生的根本原因之一，各种癌基因都可以成为肿瘤基因治疗的靶点。利用基因家族中多个基因具有同一段同源性很高的保守序列这一特性,针对这一区段序列设计相应的siRNA，通过体外合成或构建在体内表达siRNA的载体的方法转入细胞中，可以特异性的封闭这些基因的转录产物而不影响其他基因的表达。1.2RNA干扰的发现RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen）研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时所发现，为得到颜色更深的矮牵牛花而过量表达查尔酮合成酶，结果意外得到了白色和白紫杂色的矮牵牛花，并且过量表达查尔酮合成酶的矮牵牛花中查尔酮合成酶的浓度比正常矮牵牛花中的浓度低50倍。约根森推测外源转入的编码查尔酮合成酶的基因同时抑制了花中内源查尔酮合成酶基因的表达[5]。1992年，罗马诺（Romano）和Macino也在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达[6]。1995年，Guo和Kemphues在线虫中也发现了RNA干扰现象[7]。1998年，安德鲁·法厄（AndrewZ.Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出了更强的抑制效果[1]。从与靶mRNA的分子量比考虑，加入的双链RNA的抑制效果要强于理论上1:1配对时的抑制效果，因此推测在双链RNA引导的抑制过程中存在某种扩增效应并且有某种酶活性参与其中。并且将这种现象命名为RNA干扰。2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（CraigC.Mello）由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。第二章作用机制2.1RNA干扰的作用机制RNAi的第一步是：dsRNA（双链RNA）在内切核酸酶(一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶，称为Dicer.)作用下加工裂解形成21～25nt（核苷酸）的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA,即siRNA。果蝇中RNaseIII样核酸酶Dicer含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域.已发现在哺乳动物中也存在Dicer同类物.RNAi的第二步是：siRNA与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC(由siRNA中的反义链指导形成)，RISC复合物中含siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶\同源RNA链搜索活性等，其中的siRNA解链成为单链，由其中的反义链识别与其同源的靶mRNA，并与靶mRNA配对结合，在mRNA的近中点位置将靶mRNA切割，并由RISC中的酶把靶mRNA降解，从而阻断了mRNA传递遗传信息的功能。siRNA可作为一种特殊引物,在RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者可被降解形成新的siRNA;新生成的siRNA又可进入上述循环.这种过程称为随机降解性多聚酶链反应(randomdegradativePCR).新生的dsRNA反复合成和降解,不断产生新的siRNA,从而使靶mRNA渐进性减少,呈现基因沉默现象.RdRp一般只对所表达的靶mRNA发挥作用,这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能.每个细胞只需要少量dsRNA即能完全关闭相应基因表达,可见RNAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征.（在植物和线虫中存在的信号放大过程，但是在哺乳动物中不存在这种现象,可能与在哺乳动物体中siRNA不能作为RdR的引物有关。）此外，：解开siRNA的双链后，反义RNA链能作为双链RNA合成的一个引物，以mRNA为模板，(RNAdependentRNApolymerases，RdRPs，又称作RDRs)的作用下形成新的dsRNA，并再次被Dicer识别并切断后形成新的siRNA，这种新产生的siRNA(次级siRNA,secondarysiRNA)又可形成更多的RISC复合物并作用于mRNA，使mRNA降解。因此小剂量的dsRNA即可诱导强大的PTGS，即PTGS具有类似于激素作用或PCR那样的级联放大效应。最新的研究进一步揭示,ATP在siRNA介导的RNAi中具有重要作用.较长dsRNA向siRNA的转变要有ATP参与.siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360kD的蛋白PRNA复合体;随之,siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA复合体(RISC),此步具有ATP依赖性.RISC活性复合体对靶mRNA的识别和切割作用,这一步可能不需ATP参与.此外,ATP使siRNA5′端带上磷酸分子,且对siRNA的功能具有重要作用.上述过程中siRNA双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变,因为siRNA双链体与细胞裂解物、ATP等孵育后再除去ATP及其它辅助因子,含有siRNA的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA分子2.2RNA干扰的分子抑制机制2.2.1转录抑制与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptionalgenesilencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。2.2.2转录后抑制不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。2.2.3翻译抑制Grishok等[8]在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(smalltemporalRNA)。ssRNA的形成是