植物体内游离脯氨酸含量的测定

目的意义植物在正常条件下游离脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高温、低温、盐碱、水涝等逆境条件下便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性呈正相关关系。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标，测定其含量也成为抗性生理研究的重要内容之一。本实验的目的是掌握游离脯氨酸含量的测定方法、原理及操作技术。一、酸性茚三酮法（一）原理植物体内的氨基酸只有脯氨酸能与酸性茚三酮发生反应，生成稳定的红色产物。该产物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值与脯氨酸的含量呈直线关系。因此，样品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法测定。除脯氨酸外，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应只有轻度干扰，在同类样品的测定中可忽略不计，在不同样品的测定中可加入人造沸石排除这种干扰。（二）实验材料、仪器与试剂1.实验材料：正常生长与经逆境处理的植物茎、叶、穗等器官或组织。2.仪器：分光光度计、分析天平、离心机、温箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、镊子、纱布、研钵、漏斗、滤纸、具塞刻度试管、量筒、培养皿等。3.试剂：（1）酸性茚三酮试剂：称取重结晶茚三酮放入烧杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL于70℃下溶解，冷却后装入棕色瓶内贮于4℃冰箱中，24h内稳定。现用现配。（2）100μg·mL-1脯氨酸母液：精确称取脯氨酸溶于少量80％乙醇中，用蒸馏水定容至100mL。（3）其他试剂：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80％乙醇。（三）操作步骤1.标准曲线制作：（1）取7个50mL容量瓶，分别放入脯氨酸母液、、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为、、、、、、μg·mL-1。（2）另取具塞刻度试管8只（0～7号），0号加入2mL蒸馏水，1～7号分别加入不同浓度的标准系列各2mL，再分别加入冰醋酸2mL和茚三酮试剂2mL，充分摇匀，加盖，沸水浴10～15min。以0号管溶液为空白对照，于515nm处比色，记录消光值，以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.样品提取：称取鲜样～，放入研钵或匀浆器中，加入80％乙醇3mL和石英砂少许研成匀浆，移入具塞刻度试管中，并用80％乙醇冲洗研钵，匀浆液与洗液合并总量为10mL，加盖后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末，振荡过滤（用80％乙醇冲洗滤纸与残渣3次），滤液于80～85℃水浴上蒸去乙醇，残渣用蒸馏水洗涤并定容至100mL供测定之用。3.样品测定：取大试管1只，加样品提取液10mL和人造沸石1g，摇动10min并滤去人造沸石。取具塞刻度试管2只，各加入上述过滤样液2mL、冰醋酸2mL、茚三酮试剂2mL，摇匀后加盖，于沸水浴中煮沸10～15min，冷却后于515nm下比色，记录OD值。（四）结果计算WVCA式中：A为样品脯氨酸含量（μg·g-1）；C为从标准曲线上查得脯氨酸浓度（μg·mL-1）；V为样品稀释体积（mL）；W为样品重量（g）。【附注】脯氨酸与茚三酮于100℃下的反应时间需严格控制，不宜过久，否则将产生沉淀。二、磺基水杨酸法（一）原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中。色素颜色的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色测定吸光度，从标准曲线上查出脯氨酸的含量。（二）实验材料、仪器与试剂1.实验材料：待测植物（水稻小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。2.仪器：分光光度计、冰浴锅、研钵、小烧杯、容量瓶、具塞刻度试管、普通试管、移液管、注射器、漏斗、滤纸、剪刀等。3.试剂：（1）酸性茚三酮溶液：将茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL6mol·L-1磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。（2）3％磺基水杨酸：称取3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL。（3）其他试剂：冰醋酸、甲苯。（三）操作步骤1．标准曲线的制作（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液浓度为100μg·mL-1。（2）取6个50mL容量瓶，分别加入脯氨酸原液、、、、、，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为l、2、3、4、5、6μg·mL-1。（3）取6支具塞刻度试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）以消光值为纵坐标，脯氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。2．样品的测定（1）准确称取不同处理的待测植物叶片各，分别置于具塞刻度试管中，然后向各管分别加入5mL3％磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2mL提取液于另一干净的具塞刻度试管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4mL甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10mL离心管中，以3000rpm离心5min。（4）用注射器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，记录吸光度值。（四）结果计算1001056WCA式中：A为样品脯氨酸含量（％）；C为测定液中脯氨酸浓度（μg·mL-1）；5为3％磺基水杨酸的量（mL）；W为样品鲜重（g）。