有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验

第五篇有关免疫调节剂筛选及评估机体免疫状态的实验第一章检测非特异免疫功能的实验第一节小白鼠碳粉廓清试验基本原理静脉注射一定大小的颗粒物质，迅速被肝、脾等器官内网状内皮细胞吞噬而使其在血浆浓度降低，因此可从其廓清率了解整个单核巨噬细胞系统的吞噬功能。材料和仪器印度墨汁0.1%Na2CO3溶液毛细滴管72分光光度计操作步骤1．体重18一22g小白鼠，雌雄各半，随机分为实验组与对照组。2．每鼠尾静脉注射印度墨汁0.05ml/kg体重，于l（t1）和5（t5）分钟后分别从眼眶静脉取血20ul，加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀；3．用72型分光光度计在680mm下比色,测光密度（以下分别用OD1和OD5来表示l分钟和5分钟所取血样的光密度）；4．按下式计算廓清指数K值：廓清指数K=LogOD1－logOD5=LogOD1/OD5T5-t14K值经体重及肝脾重换算后．得吞噬指数α值：吞噬指数α＝体重／肝脾重×3k以X±ＳＤ来表示给药组与对照组的k值和α值，进行组间t检验，比较差异的显著性。注意事项1.印度墨汁应用生理盐水稀释l一5倍左右。最好经超声处理后离心，弃出沉淀物，以免凝集的碳粒阻塞肺毛细血管，引起动物致死。2.尾静脉注射要熟练，取血时间也可延长至10分钟，但必须准确无误。参考文献刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社258-259（张璐刘辉）第二节小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验基本原理通过定量地观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况，反映小鼠巨噬细胞的吞噬能力。材料和仪器5％鸡红细胞生理盐水悬液37℃孵箱固定液：1:1丙酮－甲醇溶液染色液：4％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液垫有湿纱布的搪瓷盒操作步骤1取体重18一22g的健康小白鼠．随机分成给药组试验组、阴性对照组和阳性对照组。2每鼠腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水悬液0.5ml。38-12小时后,颈推脱臼处死小鼠；正中剪开腹壁皮肤，经腹膜注入生理盐水2m1，轻轻按揉鼠腹部1分种，然后吸出腹腔洗液lml，分滴于两片载玻片上，放人垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30分钟。4以生理盐水漂洗，以除去未粘片的细胞，晾干。51:1丙酮－甲醇溶液固定5分钟。64％（V／V）Glemsa一磷酸缓冲液染色3分钟，用流水冲洗，晾干。7结果判定：油镜下计数巨噬细胞，每片200个按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬百分率＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数×100%200个巨噬细胞（吞及未吞噬的）吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞÷2２００个巨噬细胞在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度，借以判定巨噬细胞吞噬和消化功能．通常分为4级：Ｉ级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄绿色，胞核浅紫红色。II级；轻度消化。胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫蓝色。III级：重度消化。胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。IV级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐．胞核隐约可见。注意事项1.实验过程中应注意无菌操作。2.若筛选免疫抑制药，预先可用巨噬细胞诱导剂，在实验前3—4天，腹腔注射0.5％淀粉生理盐水溶液，每鼠0.5ml。免疫增强剂多可激活小鼠腹腔巨噬细胞，并增强其吞噬功能一般不再使用巨噬细胞诱导剂。3.若滴片染色过深，可用1％HCI脱色；过浅则可复染。4.每鼠两片的计数应基本一致，若差距过大，应予淘汰。由小鼠腹腔吸出的液体为出血性渗出液时，不宜使用。5.必要时用低渗法溶解胞外红细胞，这样容易鉴别细胞内外的鸡红细胞。6.本法简便．但难于测定吞噬速率及其动力学改变，而且费时。参考文献1.巴德年1998当代免疫学技术与应用．北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，261－263（张璐刘辉）第三节溶菌酶测定法（光学法）基本原理体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，将检品与菌液混合，用分光光度计观察指定时间内透光度改变的百分数反映溶菌酶的活性。材料与仪器菌种；溶壁微球菌（MicrococusLysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１个月传代１次或冻干成菌种保存。PH6.4,1/15M磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）：①1/15M磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾9.04g,，加蒸馏水至1000ml。②1/15M磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠·2H2O11.87g，加蒸馏水至1000ml。③PH6.4,1/15MPBS：1/15M磷酸二氢钾溶液73ml,1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯化钠0.5g混匀，溶解即成。溶菌酶标准品：结晶纯品。5N氢氧化钾：氢氧化钾56g加蒸馏水至200ml。分光光度计操作步骤1.菌液制备：将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24一36小时．用PH6.4、1/15MPBS洗下，配成混悬菌液。用分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度达到透光率３０—40％。2.溶菌酶标准液：称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l／15MPBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。3.检品应根据估计溶菌酶含量作适当稀释．取适当稀释（或不稀释）检品0.2ml放小试管内。置37℃水浴箱预热5分钟，再向管内加人预热的菌液1.8ml混匀，立即记下开始时间，至2分钟时加入1滴5N氢氧化钾停止反应，立即将菌液倒入比色杯内．用640nm滤光板，0.5cm比色杯测其透光率T1%。4.另取同样浓度的检品0.2ml．先加入1滴5N氢氧化钾摇匀，在37℃预热５分钟，再加入1.8ml经37℃预热的菌液，在同样温度下2分钟后同法测定其透光率Ｔ0。T１／一Ｔ0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化，从标准曲线上可查得检品中溶菌酶含量。5.计算：以0.2ml各种浓度的溶菌酶标准液代替检品，操作步骤与待检品相同。以不同浓度标准液测得的透光率差值为纵坐标（对数坐标），溶菌酶浓度为横坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。按检品的T％（2分钟的读数减去零时的读数）查出其对数，由标准曲线上查出稀释的检品中溶菌酶的含量，乘以稀释倍数，即为检品中溶菌酶的含量。注意事项溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、唾液、痰、鼻涕、白细胞和血清等。测定它在体液或分泌物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防御功能一个指标。在选择标本及评价其意义时应予以注意。参考文献刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社260－261（张璐刘辉）第四节溶菌酶测定法（平板法）基本原理体液或分泌物中溶菌酶活性可以通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定，在混有菌液的琼脂疑胶上打孔，将检品放在孔内，一定时间后测定溶菌环的直径。可反映溶菌酶的活性。材料与仪器菌种：溶壁微球菌（MicrococusLysodeilicus）是从空气中分离出的一种革兰氏阳性球菌，菌落呈黄色，普通培养基上生长良好，１个月传代１次或冻干成菌种保存。PH6.4,1/15M磷酸盐缓冲盐水（ＰＢＳ）①1/15M磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾9.04g,，加蒸馏水至1000ml。②1/15M磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠·2H2O11.87g，加蒸馏水至1000ml。③PH6.4,1/15MPBS：1/15M磷酸二氢钾溶液73ml,1/15M磷酸氢二钠溶液27ml，氯化钠0.5g混匀，溶解即成。溶菌酶标准品：结晶纯品。普通琼脂培养基操作步骤1.菌液制备：将溶壁微球菌接种于普通琼脂斜面上，37℃培养24一36小时．用PH6.4、1/15MPBS洗下，配成混悬菌液。用72型分光光度计波长640nm测定，并调整其浓度达到透光率３０—40％。2.溶菌酶标准液：称取溶菌酶标准纯品，用PH6.4、l／15MPBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。临用时再稀释成100、50、25及10ug／ml标准液。3.加热融化1.2%琼脂粉，待冷却至60-70℃时将溶壁微球菌混入摇匀，使其浓度为1mg/ml，立即倾入已夹好的两玻片中（厚度为4mm）。4.待琼脂凝固后，以15mm间隔，用打孔器穿钻2.5mm直径小孔，每孔中加入20ul检样品，并在同一板上加上不同浓度的标准溶菌酶样品，置24-26℃，12-18小时，用测微尺测溶菌环的直径。5.用半对数纸（以溶菌酶浓度为纵坐标，即对数坐标，溶菌环直径为横坐标）绘制标准曲线。从线上查出每毫升样品所含溶菌酶的ug数。注意事项在缺乏培养细菌的条件下也可使用干菌粉，将溶壁微球菌24小时培养物用60倍体积蒸馏水洗下，离心沉淀弃上清液，沉积的菌体加约5倍体积的丙酮，用玻棒搅匀，放冰箱内30分钟、取出离心沉淀弃上清液。按此法用丙酮浸洗3次，再用乙醚洗2次，将菌体放于燥器内过夜，即得干菌粉。用乳体研碎备用，使用时称干菌粉500mg，放人上述磷酸缓冲液约50ml，如上调整菌液浓度约30一40%.参考文献刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社260－261（张璐刘辉）第二章检测特异性免疫功能的实验第一节血清溶血素测定基本原理经绵羊红细胞（SRBC）免疫动物的淋巴细胞可产生抗SRBC抗体（溶血素）。并释放至外周血。这种抗体在试管内与SRBC温育．在补体参与下可产生溶血反应．免疫动物血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中释放的血红蛋白来测出。材料与仪器SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.8g，蒸溜水100ml，无菌过滤（Ｇ５漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用。都氏试剂（测血红蛋白用）；碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，蒸馏水1000ml。补体：新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC（10:1）于4℃吸收30分钟后置-20℃以下备用。SRBC：在无菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2倍量的保存液，置4℃冰箱备用。临用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。操作步骤1.免疫；小鼠腹腔注射20％SRBC0.2ml／天，免疫后第4天去眼球或腹动脉取血，分离血清，将血清稀释（一般500倍以上）后供测定。2.溶血反应：反应管内依次加人经稀释的血清lml，5％SRBC0.5ml，10％补体lml．置3.37℃恒温水浴中保温30分钟，然后移至冰浴中终止反应，1500rpm离心5分钟，取血清液lml加都氏试剂3ml，摇匀放置10分钟，于540nm波长比色读取吸光度。4.SRBC半数溶血值：取５％SRBC0.25ml加都氏液至4ml，比色读取吸光度值，即为实验中所用SRBC半数溶血时的吸光度值。5.计算：样品管中数溶血值CH50按下式计算：每只鼠的血清CH50=样品的吸光度值×稀释倍数SRBC半数溶血时的吸光度值注意事项免疫用SRBC浓度可根据不同品系小鼠的敏感度和试验药物的作用强度作调整。参考文献刘辉2000研究生免疫学教程大连大连出版社261－262（张璐刘辉）第二节抗体形成细胞测定基本原理将经SRBC免疫的小鼠脾细胞、SRBC（靶细胞）及补体一起混合于琼脂内，抗体形成细胞分泌的抗体在补体参与下；使其周围的SRBC溶解形成肉眼可见的溶血空斑，这种溶血空斑数大体上可以反映抗体形成细胞数。材料与仪器SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化钠0.42g，柠檬酸钠0.8g，蒸溜水100ml，无菌过滤（Ｇ５漏斗）或8磅10分钟灭菌后备用。SRBC：在无菌条件下，自健康成年绵羊外颈静脉取血，置血液于有玻璃珠的三角烧瓶中轻摇10分钟以除去纤维蛋白，加人2倍量的保存液，置4℃冰箱备用。临用时用生理盐水洗涤3次，经2000rpm10分钟得压积红细胞，再按所需浓度稀释。100目尼龙网纱布Hank's液（见附录）琼脂粉0.4%台盼蓝生理盐水补体：新鲜豚鼠（至少3只）混合血清经SRBC（10:1）于4℃吸收30分钟后置-20℃以下备用。戊二醛37℃温箱等操作步骤1.免疫：用20％SRBC0.2ml／只腹腔注射免疫小鼠。免疫后第4天处死供实验