维生素C的定量测定—2,6-二氯酚靛酚滴定法实验目的1.学习定量维生素C的原理和方法2.掌握微量滴定技术实验原理维生素C是人类营养中最重要的维生素之一,缺乏时会产生坏血病,因此,又称为抗坏血酸。它对物质代谢的调节具有重要的作用,近年来发现它还能增强机体对肿瘤的抵抗力,并具有对化学致癌物的阻断作用。维生素C是具有L-系糖构型的不饱和多羟基化合物,属于水溶性维生素。它分布很广,植物的绿色部分及许多水果(桔类、草莓、山楂、辣椒等)的含量都很丰富。维生素C具有很强的还原性,在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时,维生素C易被氧化而破坏。在中性和微酸性环境中,维生素C能将染料2,6—二氯酚靛酚还原成无色的还原型的2,6—二氯酚靛酚,同时将维生素C氧化成脱氢维生素C。氧化型的2,6—二氯酚靛酚在酸性溶液中呈现红色,在中性或碱性溶液中呈兰色。当用2,6—二氯酚靛酚滴定含有维生素C的酸性溶液时,在维生素C尚未全被氧化时,滴下的2,6—二氯酚靛酚立即被还原成无色。但当溶液中的维生素C刚好全部被氧化时,滴下的2,6—二氯酚靛酚立即时溶液呈红色。所以,当溶液由无色变为微红色时即表示溶液中的维生素C刚好全部被氧化,此时即为滴定终点,从滴定时2,6—二氯酚靛酚溶液的消耗量,可以计算出被检物质中还原型维生素C的含量。其化学反应式如下:仪器、试剂(一)仪器:研钵、天平、容量瓶(100ml)、量筒、移液管、锥形瓶(50ml)、微量滴定管、漏斗(二)材料、试剂ooHOHOHOHCCCCCCHH2OHOClClNOHO-NClClOOHNClClOH2OHHCCCCCCHHOOOooH+OH-(兰色)2,6-二氯酚靛酚(红色)抗坏血酸HH脱氢抗坏血酸还原型2,6-二氯酚靛酚(无色)1、新鲜蔬菜或新鲜水果2、1%草酸溶液1g草酸溶于100ml蒸馏水中3、2%草酸溶液2g草酸溶于100ml蒸馏水中4、标准维生素C溶液准确称取20mg纯维生素C粉状结晶于1%草酸溶液中,稀释至100ml,再取其中10ml稀释至100ml,即得0.02mg/ml的维生素C溶液。在使用前临时配制。5、0.02%2,6—二氯酚靛酚溶液溶解50mg2,6—二氯酚靛酚于约200ml含有52mg的NaHCO3的热水中,冷后稀释至250ml,过滤,装于棕色瓶中,放入冰箱中保存。使用时用维生素C标准液标定其浓度。实验步骤(一)2,6—二氯酚靛酚溶液的标定:取5ml维生素C标准液及5ml1%草酸溶液于50ml的锥形瓶中,用配制好的2,6—二氯酚靛酚溶液于微量滴定管中滴定至粉红色出现,并保持15s不褪色,即滴定终点,此时所用染料的体积相当于0.1mg维生素C,由此可求出每ml2,6—二氯酚靛酚溶液相当于维生素C的mg数。(二)称取新鲜蔬菜或水果(要有大、中、小各部分的代表,洗净,除去不可食部分,切碎,混匀)约10克,于研钵中,加入等体积的2%草酸溶液研磨成浆状,得匀浆液。将匀浆液移入100ml容量瓶中,可用1%草酸溶液帮助转移,加入30%Zn(AC)2和15%K4Fe(CN)6溶液各5ml,脱色,然后用1%的草酸稀释至刻度,充分摇匀,静止几分钟后过滤。(弃去最初流出的几毫升溶液)(三)用移液管吸取滤液5或10ml于50ml的锥形瓶中,立即用标定过的2,6—二氯酚靛酚溶液滴定,直至溶液呈浅粉红色15s不褪色为止。记录所用染料的ml数。为了避免其它物质的干扰,滴定过程不得超过2min。(此步骤平行作2—3次)(一)计算维生素C含量(mg/100g样品)=(VT/W)×100式中:V为滴定样品所耗用的染料的平均ml数T为1ml染料相当于维生素C的mg数W为滴定时所用样品稀释液中含样品的g数注意事项1.整个滴定过程要迅速,防止还原型的维生素C被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应少于1ml或多于4ml,若滴定结果不在此范围,则必须增减样品量或将提取液稀释;2.本实验必须在酸性条件下进行,在此条件下,干扰物反应进行很慢;3.提取液中尚含有其它还原性的物质,均可与2,6—二氯酚靛酚反应,但反应速度均较维生素C慢,因而,滴定开始时,染料要迅速加入,而后尽可能一滴一滴地加入,并要不断地摇动锥形瓶直至呈粉红色15s不褪色为终点;4.若提取液中色素很多时,滴定不易看出颜色变化,需脱色,可用白陶土、30%Zn(AC)2和15%K4Fe(CN)6溶液等,本实验用30%Zn(AC)2和15%K4Fe(CN)6溶液脱色,若色素不多,可不脱色,直接滴定。5.在生物组织和组织提取液中,维生素C还能以脱氢维生素C及结合维生素C的形式存在,它们同样具有维生素C的生理作用,但不能将2,6—二氯酚靛酚还原脱色.6.2%草酸有抑制抗坏血酸酶的作用,而1%的草酸无此作用思考题1.指出3—4种维生素C含量丰富的物质。2.为了准确测定维生素C的含量,实验过程中应注意哪些操作步骤?为什么?