转基因动物技术原理与应用

利用小鼠动物模型研究基因表达与病理发育郑耀武转基因动物实验中心综合实验楼[e-mail]85098583转基因动物技术原理与应用第一部分：常规转基因技术原理第二部分：基因定位修饰技术原理第三部分：CRISPR/Cas9技术原理与应用第一部分常规转基因动物原理与应用什么是转基因？•狭义：人为将DNA片段插入基因组•广义：人为的对生物基因组的修饰，包括随机的基因片段插入，基因定位敲除，基因定位敲入，基因定点突变等动物转基因的重要性基础理论研究（小鼠）•研究基因调节，包括启动子功能•基因功能追踪（Knockout，GeneTrap）•细胞追踪，如癌细胞转移（如EGFP基因敲入）•基因表达与胚胎发育，器官发育•基因表达与生物学功能、病理发育•基因突变体表达功能研究•基因相互作用应用研究（大动物）•生产活性蛋白：酶，疫苗，抗体，生长因子，蛋白药（蛋白活性要求特异的翻译后修饰）•低生产成本：转基因动物可以传代，可以连续生产，如血浆蛋白，乳蛋白，比细胞培养成本低•病理动物模型，利用动物模型研究疾病发生机理、药效测试•器官移植：解决器官不足，重复感染问题，如猪肝脏•品种改良(GMO)：抗病，高产，营养价值提升•疾病治疗：治疗遗传缺陷，组织再生转基因技术研究历史•第一个转基因小鼠：1974年•第一个小鼠干细胞：1981年•第一个基因捕获小鼠：1989年•第一个基因敲除小鼠：1997年•第一个克隆动物：2008年•第一个CRISPR/CAS9小鼠RudolfJaenischin1974.JaenishsuccessfullymanagedtoinsertforeignDNAintoearly-stagemouseembryoresultingmicecarriedmodifiedgeneinalltheirtissuesandprogeny.Gossler,A.,A.L.Joyner,etal.(1989).Mouseembryonicstemcellsandreporterconstructstodetectdevelopmentallyregulatedgenes.Science244(4903):463-5.MartinGR.Isolationofapluripotentcelllinefromealrymouseembryosculturedinmediumconditionedbyteratocarcinomastemcells.ProcNatlAcadSci(USA).1981;78:7634-8.HooperM,HardyK,HandysideA,HunterS,MonkM.HPRT-deficient(Lesch-Nyhan)mouseembryosderivedfromgermlinecolonizationbyculturedcells.Nature.1987;326:292-5.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.Science.2013Feb15;339(6121):819-23.doi:10.1126/science.1231143.Epub2013Jan3.Dolly(5July1996–14February2003)wasafemaledomesticsheep,andthefirstmammaltobeclonedfromanadultsomaticcell,usingtheprocessofnucleartransfer.常见转基因技术•常规方法：受精卵细胞核DNA显微注射，随机插入，预见性低，但多样性•利用精子转染DNA，效率低，重复性差•利用转坐子进行DNA在基因组的插入，方法复杂，受限多•病毒感染：效率高，随机性低，可带DNA大小受限制，安全隐患，常用于大动物•干细胞／胚胎显微注射：常用于小鼠基因定位修饰，预见性高，费时，大动物不成功•核移植／动物克隆：大动物基因定位修饰唯一途径•CRISPR/Cas9技术：最新发展的，快速、简便、高效基因组修饰技术真核基因结构与调节•真核基因结构（ciselement)：启动子(promoter)，外显子(exon)，内含子(intron)，polyA信号,活化信号（enhancers),沉默信号（silencers），封闭区(Insulators)•转录因子(transelement)(transcriptionfactors)，活化因子(activators)，抑制因子(inhibitors)•真核mRNA结构：Cap，5’非编码区(5’-UT)，编码区(codingregion)，3’非编码区(3’-UT)，polyA•组织专一性调节(tissue-specificregulation,spatial)•发育阶段调节(developmentalregulation,timingly)•诱导性调节(inducible)•转录后调节:mRNA剪接和修饰，mRNA的稳定性，蛋白质合成效率，蛋白质半衰期基因结构图示mRNA结构IV3’-UTAATAAAExonI5’-UTRAAAAAAAAA3’-UTRIIIIIIVIntronI翻译起始点ExonIICCAATboxTATAboxEnhancer转录起始点ExonI5’UT…基因转录复合体转基因载体构建•启动子选取•cDNA选取•PolyA选用•内含子和封闭区•载体构建启动子的类型和选取•特异启动子：研究基因调节（lacZ），启动子功能，调节其它基因表达。–用于其它基因表达，一定要查询启动子在转基因动物应用文献，了解启动子完整性•高表达启动子选用：用于高表达某个基因，高表达蛋白生产•广谱启动子应用：显示基因细胞标记（EGFP）•可诱导启动子的应用：用于基因调节，有毒蛋白表达，致命基因的调控•复合启动子：可诱导、高表达、组织专一基因调节系统，用于调节基因或高表达蛋白表达基因（cDNA）的类别•显示基因(reporters):lacZ,GFP,CAT,AP等•调节基因:Cre,ER-Cre,tTA,tTR,PTX等•蛋白质功能研究：蛋白突变体的表达•基因剪接：研究外显子、内含子功能•商业基因：药用蛋白，改良基因等•生理功能基因:基因治疗，干细胞移植等•非编码基因：非编码RNA功能研究，siRNA基因沉默,CRISPR/Cas9gRNA基因组修饰•抗性基因：细胞筛选其它转基因载体构件选取•polyA：提供稳定的mRNA•常用polyA:SV40polyA,-GlobinpolyA•内含子选用：第一个内含子，如-Globin内含子•封闭区应用：增加表达几率，减少对周围或被周围基因影响•Loxp,FRT,tetO序列基因A启动子典型转基因结构（Heterologous）CCAATboxTATAboxEnhancer转录起始点基因BcDNA翻译起始点基因CpolyA5’-UT3’-UT拼接区域：转基因动物（Founders）鉴定•检测转基因在基因组插入：–PCR–Southern•拷贝数：Southern,RealtimePCR•插入位点：InversePCR•mRNA表达：–InSitu–RT-PCR–Northern•蛋白表达：–显示基因：酶活性分析lacZ，Luciferase，AP,荧光EGFP,RFP–功能分析：–结构变化：石蜡切片，H&E染色–免疫组织化学、免疫荧光定位：冰冻切片，抗体染色–免疫沉淀：Western小鼠生物学基础及转基因优越性•小鼠免疫力强，繁殖率高，体型小，为经济有效动物模型•小鼠遗传表型多样，全基因组序列解析，经典哺乳类实验动物模型•多种自交系•孕期19－21天•性成熟时间：母4－5周，雄5-6周•母鼠发情周期5天左右•成鼠体重：20-50克•母鼠平均产子5－6窝，自交系每窝6-8只，远交系10-14只产生转基因鼠标准条件和要求•洁净动物房，高蛋白，高脂肪饲料（Breederchows)•供卵鼠：4-6周杂交子一代母鼠(C57B6xCBAorDBA),每次10-12只，每周两次•种鼠：年龄两月到一年的杂交子一代雄鼠(C57B6xCBAorDBA)20-24只•代孕母鼠：每次见栓2-5只，2-6月高繁殖率母鼠(CD1)50-100只•结扎公鼠：(C57B6xCBAorDBA)子一代或(CD1)雄鼠，各需求10-20只，适用年龄2-18月转基因小鼠具体操作过程•构建载体，纯化DNA片段，去除原核载体序列•促排卵激素超排卵，合笼，分离E0.5受精卵•DNA显微注射•胚胎培养过夜•胚胎回移代孕鼠•切尾鉴定•传代杂交•表达分析转基因鼠建立时间表注射出生分窝传代F1出生分窝分析孕期转基因鼠鉴定传代鉴定性成熟孕期时间（月）012345出生率30－50%转基因比率15－50%传代效率~90%性成熟•供体受精卵收集，每次100－200个•供体受精卵细胞核DNA显微注射浓度:2-5ng/ul•受精卵回移代孕母鼠:每只移植20-30个左右双细胞卵•PCR或Southern筛选转基因鼠(founders),15-50%,随机插入，拷贝数1-≥100•第一代下传（F1)0-100%，有卵裂后插入或两个以上的插入位点•第二带下传，蒙德尔遗传，50％•表达功能分析：从E10到5个月转基因鼠产生相关的数据转基因常见问题•启动子不完整，造成基因不表达或错误表达•DNA插入随机性造成不表达、低表达、鼠系间差异•封闭区(insulaters)序列•基因高表达毒性，得不到转基因鼠或不表达•第一个内含子重要性•转基因片段的大小：–2kb到1000kb–大部分2-10kb,容易注射–P1质粒(PAC),70kb左右，黏度大–细菌人工染色体BAC，120kb左右，黏度更大–酵母人工染色体YAC，500kb-1000kb，非常难注射•同时注射两个以上的转基因：效率高，一般插入同一位点•多拷贝插入方式：头尾相接•拷贝数与表达水平：无紧密关联，多数拷贝被甲基化，转录因子浓度限制•其它因素：DNA浓度(2-3ng/ul)，酒精、嗅化乙锭和EDTA残留•载体骨架DNA对转基因表达影响：原核序列不稳定•C57/BL6纯系转基因鼠受精卵注射：效率略低转基因动物原理及应用第一部分：常规动物转基因技术原理第二部分：基因定位修饰技术原理第三部分：CRISPR/Cas9技术原理与应用第二部分：基因定位修饰•基因定位修饰原理•基因定位修饰过程•基因定位修饰应用基因定位修饰重要性•基因功能研究：随着基因组解析，基因敲除和基因定位修饰进行基因功能解析•基因调节：可以人为控制基因位点准确修饰，基因调节更为精确，研究结果更确定，病理模型更有价值•基因修饰稳定性，低拷贝，对基因组影响小，表达特定蛋白，大动物克隆，抗体基因组置换•基因治疗：准确定位修饰，结合人类干细胞培养和CRISPR/Cas9技术，是将来基因治疗(GeneTherapy)、组织再生(RegenerationMedicine)重要途径小鼠早期发育示意图3.5天干细胞特性•祖细胞(projenitorcells)的特性–可以分化成少数不同种类细胞的原性细胞，可以进行有限次数的不等分裂•干细胞(stemcell)的特性–可以分化成多种组织器官、不断增殖的少数细胞•胚胎干细胞(ES)具有全能性每个细胞可以发育分化成任何组织器官、个体•小鼠胚胎干细胞来源：–囊胚内细胞群(ICM)–来源种系：多数129SV/jae,少数C57/BL6–毛色：棕色(129),黑色(C57/BL6)–性别：雄性干细胞更稳定GeneTrap(基因捕获）•源于小鼠干细胞全能性的发现•标示基因高通量小鼠基因组随机插入，基因分析•利用无启动子标示基因表达框，前端有内含子/外显子剪接信号，后面有PolyA，中间有抗性基因•随机插入内含子后会剪接成融合表达蛋白，标示基因表达•原基因位点失活•