荧光光谱-FL.

1仪器分析InstrumentalAnalysis分子发光光谱法MolecularLuminesenceSpectrumetry分子荧光:Fluorescence;分子磷光:Phosphorescence2主要和常用的荧光磷光分光光度计及型号HITACHI（日立）F-4500荧光分光光度计荧光/磷光/发光分光光度计(PerkinElmer)LS-553§1分子发光的基本原理第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。4一.分子荧光与磷光的产生1.单重态与三重态（p79）2.分子的活化与去活化3.分子发光的类型按激发的模式分类：按分子激发态的类型分类：光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光分子发光分子发光荧光磷光瞬时荧光迟滞荧光按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)：λexλem反斯托克斯荧光(Antistokes)：λexλem共振荧光(Resonance)：λex=λem荧光5分子的活化与去活化(p78)S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:Vr10-12sec外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间跨跃:S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T1~S2１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光:102~10-4sec6二.分子荧光(磷光)光谱1.荧光(磷光)激发光谱与发射光谱荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。A.激发光谱(p79)20025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IF固定em=620nm(MAX)ex=290nm(MAX)固定发射波长扫描激发波长*MXMXn1iihvn1jjhvMXMX*荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似B.发射光谱(荧光光谱)固定激发波长扫描发射波长72.三维荧光光谱IF∝f(λex、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长8IF∝f(λex、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长9蒽的三维等高线光谱图10蒽的三维等荧光强度光谱11VB1和VB2的三维荧光光谱1220025030035040045050055060065070075080085090004008001200160020002400280032003600400044004800IFex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)2.激发光谱与发射光谱的镜像关系S04321S143211.发射光谱的形状与激发波长无关分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1→41→31→21→11→11→21→31→4三、荧光(磷光)光谱的特征(p81)133.斯托克斯位移14对于稀溶液，当bc0.05（磷光bc0.01）时：CbεIk30.2I0FFIF----荧光强度F-----荧光量子产率k--与仪器灵敏度有关的参数I0--入射光强度。CbεIk30.2I0PPIP----磷光强度P-----磷光量子产率b--吸收光程--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度CKIFKCIP四.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系1.荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）bC303.20teT,bCIIlgTlgA152.荧光(磷光)的平均寿命分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/2所经历的时间。n1iikkF(P)F(P)1It=I0e-t/TlnIt-t作图得一直线，又斜率可以求得荧光寿命的数值。利用荧光寿命可以进行荧光化合物分析。163.荧光(磷光)的量子产率荧光量子产率的定义：(p91)激发分子总数发射荧光的分子数Fn1iiFFFkkkkF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；st系间窜跃效率。ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55；荧光素F=1化合物F0.110.290.460.600.52激发分子总数发射磷光的分子数Pn1iiPPstPkkk171.跃迁的类型二.荧光与有机化合物的结构对于有机荧光物质:π*→πn→π*εmax＜100平均寿命10-5~10-7secπ→π*εmax≥104平均寿命10-7~10-9seckS→T小π*→nπ*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。强荧光的有机化合物具备下特征:①具有大的共轭π键结构；②具有刚性的平面结构；③具有最低的单重电子激发态为S1为π*→π型；④取代基团为给电子取代基。§2分子荧光与磷光强度的影响因素一.荧光的量子产率182.共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.52荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。3.刚性平面结构芴联苯F=1F=0.219NNNN不产生荧光产生荧光CCOO-O-OCOCOO-O-O产生荧光不产生荧光F=0.92CH2OHCH3H3C萘VAF(萘)=5F(VA)荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯201）给电子取代剂加强荧光4.取代基效应—NH2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）得电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=O，—COOH，—NO2不产生p→π共轭ONO2硝基苯：不产生荧光、弱磷光21空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质NCH3H3C-O3SNCH3H3CSO3-F=0.75F=0.03CCHHCCHH立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质电离效应对荧光发射的影响(pH值)OHO-OHO-OH-H+OH-H+pH=1,有荧光pH=13,无荧光无荧光有荧光22含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。5.重原子取代基效应—Cl，—Br，—IS1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488P/F0.0930.0530.0685.26.41000τp(s)2.62.51.40.230.0140.00236.环境因素：溶剂效应、温度蓝移:△En→π*＜△En→π*红移:△Eπ→π*＞△Eπ→π*在极性溶剂中：无溶剂化作用有溶剂化作用23三.金属螯合物的荧光1.螯合物中配位体的发光2.螯合物中金属离子的发光NOHNOZn8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光NNOOAlNNOHHO2,2`-二羟基偶氮苯无荧光2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光T1系间窜跃S0S1d*、f*d*→df*→f荧光分子内能量转移24四.荧光的猝灭1.碰撞熄灭荧光猝灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光猝灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光猝灭剂。Hhvhvk*,k**1ΔQMQMMMMM2相对速率1K1[M*]K2[M*][Q]与分子的直径、粘度、温度等因素有关。2.能量转移熄灭*,*hvhvAADD再吸收过程：)(A)D()A()(D)(A)D()A()(D1*0011*001SSSTSSSS**共振能量转移：分子内能量转移：NCH3CH3NCH3CH3+_hv激发发射熄灭253.氧的熄灭作用23*3231OMOM1k*氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4.自熄灭与自吸收**hvhvDDDD当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自吸收：没有除氧，溶液中难以观察到磷光由于F1，使荧光强度减弱或消失.D)(DDD11**形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。kTM2M)M(MM*3*3*326§3荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？27二.光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型：氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射光强度大283.高压汞灯光源应用广泛的线光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射单色器光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射滤光片29三.单色器四.检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109五.样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围3.使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题激发单色器、发射单色器30紫外-可见分光光度计:光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器31紫外-可见分光光度计测量池(吸收池)荧光分光光度计样品池I0ItI0ItIF,p32六.磷光分光光度计1.光学系统与荧光分光光度计的区别光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器切光器（斩波器）共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光：100~10-4sec2.样品池与荧光分光光度计的区别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。33§４荧光分析法的应用