放射免疫测定法

第五节、放射免疫测定法(Radioimmunoassay,RIA)一、基本概念放射免疫测定（RAI）：根据抗原抗体特异性结合的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。同位素（isotope）：元素周期表中处于相同位置的某种元素所包含的若干种核素。放射性核素（radionuclide）：由于核内中子数和质子数的比例不适而自发地发生核衰变，在衰变过程中将放射出一种或几种射线而转变为别种核素的不稳定核素。1959年Yalow和Berson建立放射免疫测定（RIA）1960年竞争性蛋白结合分析（CPBA）1968年Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA）1968年放射受体分析法(RRA)1971年Addison和Hales建立双位点或夹心IRMARIA方法学研究进展基本原理：放射性标记的已知抗原（*Ag）和非标记的待检抗原（Ag）同时与限量的特异性抗体进行竞争结合或竞争性抑制反应，通过测定结合（*Ag-Ab）的或游离（*Ag）的放射性标记抗原的量，根据标准曲线即可推算出被测物含量的一种超微量分析技术。RAI属超微量分析技术，常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。二、RIA原理Ag*AgAbBoundFreeBFB/F10.500.500.670.3320.50.330.670.20.170.83竞争放射分析原理示意图常用标记放射性同位素及其性质放射性元素半衰期射线种类及能量（百万电子伏特）βγ14C5720年0.155－3H12.5年0.0189－125I60天－0．035131I8.05天0.608，0.335，0.2500.364，0.637，0.722125I的优点29种同位素，125I最为常用；半衰期适中(60天)，易于商品化和储存，也利于废物处理；发射低能35kVγ线易于测量，井型闪烁效率高；不发射β粒子，标记物自分解速度低；标记过程中，标记物免疫损伤小；化学性质活泼，标记Ag和Ab容易，可得到多种标记物而广泛应用。放射性核素标记物制备的主要方法氯胺T法活化NaI中放射性碘离子乳过氧化酶法催化过氧气化氢释放新生态氧，使125I离子活化双酶标记法葡萄糖氧化酶提供过氧化氢作为乳过氧化酶底物氯甘脲标记法活化NaI中放射性碘离子放射性同位素标记化合物的纯化方法凝胶过滤法分离标记蛋白与无机碘离子交换法用于分离纯化短肽标记物透析法将标记蛋白与小分子化合物很好地分离电泳法分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质亲和层析法利用特异抗体或受体结合分离、纯化标记蛋白质高效液相层析法分离效果好、快速ConA吸附法分离标记糖蛋白二、RIA操作程序配制已知浓度系列标准抗原（Ag）加待测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育加标记抗原（*Ag）和抗体（Ab）--温育分离复合物*AgAb（B）和游离*Ag（F）用γ计数器测量放射性计数根据标准曲线或计算机直接算出5.测量4.去上清分离立即1.加样1.样品或标准品2.标记物3.抗血清混匀温浴2.加分离剂分离剂混匀3.离心动态平衡体系中:*Ag与Ag具有同样的免疫活性和结合反应能力*Ag和Ab的量恒定Ag+*Ag的分子数大于抗体的分子数*Ag与Ag相互竞争同Ab结合，彼此抑制，待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系测抗原（Ag）和抗体（Ab）--温育沉淀法加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，离心吸附法调pH值于γ球蛋白等电点，加入适当浓度PEG或中性盐过滤法小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离双抗体法固相法SPA法入第二抗体，形成第二抗体复合物，离心抗体或抗原固相化，免疫反应在固相载体上完成后洗涤金黄色葡萄球菌A蛋白促使AgAb较快速度沉淀结合抗原(B)与游离抗原(F)分离方法三、RIA法标准曲线标记抗原与被测物质间的数量关系可以用抑制曲线来表示。这种曲线表示了结合抑制的程度与抑制物浓度两者之间的特定函数关系，也称为剂量反应曲线。标准曲线的手工绘制形态标准曲线的形态可因所用的反应变量表达形式的不同，或所采用坐标系统不同而有不同的形态。标准曲线的基本数学函数式放射免疫分析从抗原抗体反应动力学分析，反应是双向性的，服从质量作用定律。7550301001101001000未标记抗原浓度（ng/ml)结合/未结合的放射活性（%）待测Ag与*AgAb呈负相关函数关系RIA竞争抑制曲线类型注：横坐标为标记抗原（*Ag）的浓度四、建立放射免疫分析方法的必备条件对标准抗原的基本要求(1)标准抗朱与待测抗原的免疫性必须一致。(2)抗原必须纯度高。(3)标准抗原的量必须准确。(4)标准抗原应有很好的稳定性。对抗血清的要求抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。检查抗血清质量的指标主要有亲和常数(K)、免疫交叉反应率及滴度(或抗体效价)。对标记抗原的要求(1)标记抗原的免疫活性与待测抗原及标准品必须一致。(2)标记抗原要有适当高的放射性比活度。(3)标记抗原应具有足够高的放射化学纯度衡量抗体质量的指标亲和力:抗体结合的强度是RIA的前提特异性:不受交叉反应物质影响的程度滴度:抗体的效价——抗体实际应用时的稀释倍数斜率＝－KAB/F301Ag-Ab浓度亲和力测定（Scatchard作图）100500123456复合物放射性Log竞争剂浓度特异性的测定－－交叉反应检测交叉反应率＝A50/B50×100％ABCB%100806040200100100010000100000抗血清稀释度抗体滴度测定五、放射免疫分析的设计方法◆标讥抗原和抗体用量最佳化设计:1、标记抗原用量选择。2、抗血清的使用滴度选择及其方法。◆标准抗原剂量设计1、标准抗原剂量范围2、标准曲线工作范围◆加样顺序设计◆反应介质◆反应容积与温度及时间1、缩小反应容积可相应减少抗体和标记抗原的绝对用量，使非标记抗原的竞争力相应增强，有利于提高灵敏度。2、抗原、抗体结合反应的平衡结合常数K与温度有关，必须通过实验来确定最佳工作条件。◆与F分离方法选择◆样品采集与保存六、放射免疫分析的质量控制◆误差和放射免疫误差的来源(1)误差及其分类(2)放射免疫分析误差来源◆掌握质量控制与质控样品(1)放射免疫分析的质量控制内容(2)质量控制样品◆质量控制指标：灵敏度、精密度、偏倚和准确度、特异性、稳定性、临床有效性。◆实验室内部质量控制：精密度的评价、批内偏倚的评价和批间重现性评价。◆实验室间的外部质量评价。(一)、液相法已知放射标记抗原待检非标记抗原+抗原抗体抗原抗体结合+分离沉淀物抗原抗体复合物上清液中游离抗原七、RIA技术类型和应用1.直接法IRMA示意图标记抗体抗原固相抗原离心测定（二）、固相法2.双位点法IRMA示意图测定标记抗体洗涤抗体抗原八、免疫放射分析（IRMA）•基本原理：用过量的核素标记抗体与待测抗原形成复合物，并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段除去多余的游离抗体，测量抗原抗体复合物的放射性。Ag*AbAg*Ab固相抗体抗原过量的标记抗体抗原固相抗原过量标记的抗体双位点IRMA单位点IRMA结合率（%）Ag剂量RIAIRMA和RIA曲线形态比较结合率（%）Ag剂量IRMAIRMA与RIA的工作原理的主要区别项目RIAIRMA反应机制竞争性反应非竞争性全量反应灵敏度提高（10-100倍）反应试剂三种标记抗原二种标记抗体分离方法抗原只需一个抗原决定簇一般需单抗作分离剂，抗原需两个或两个以上决定簇待测抗原复合物放射性与待测抗原呈负相关与待测抗原呈正相关非特异性结合主要影响高剂量反应主要影响低剂量反应待检抗原性质半抗原及大分子蛋白质、酶等生物大分子