一、RFLP概念

RFLP分子标记法游良旺胡才民RFLP分子标记法一、RFLP概念二、RFLP技术的基本原理三、基本流程、特点四、RFLP技术的基本步骤五、RFLP的应用一、RFLP概念RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶片段长度多态性）作为第一代分子生物学标记自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中。所谓RFLP,是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,含同源序列的酶切片段在长度上的差异。20世纪70年代,限制性内切酶的发现使DNA变异研究成为可能,1974年RFLP作为遗传工具由Grodjicker创立,1980年由Botstein再次提出,并由Soller和Beckman(1983)最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定,这是第一个被应用于遗传研究的DNA分子标记技术。二、RFLP技术的基本原理限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，缩写RFLP)技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。1、点的多态性表现为DNA链中发生单个碱基的突变，且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点。Southern杂交即可诊断。2、序列多态性因DNA链内发生较大部分的缺失、重复、插入等变异，其结果是即使其内切酶位点碱基序列没有变化，但原有的内切酶位点相对位置发生变化从而导致RFLP。三、基本流程、特点RFLP技术主要包括以下基本步骤：→DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。1、RFLP标记特点优点:􀀁无表型效应,RFLP标记的检测不受性别、年龄的局限,也不会因为表达的组织、发育阶段或外界环境的不同而受影响;􀀁RFLP标记座位的等位基因之间呈共显性,因此通过电泳、杂交后的带型可以直接分析基因型;􀀁非等位的RFLP之间不存在上位互作效应,因而互不干扰;缺点多态信息含量低,绝大多数表现为2～3态;该技术复杂,耗时费力,需用放射性同位素或非同位素标记探针;成本高,且对模板DNA需求量大(5～10g)。四、RFLP技术的基本步骤1、靶DNA的准备。先将基因组DNA抽提出来,选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA,将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂搪凝胶电泳分离,使其按片段的长短排列,将DNA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上,称印迹(Southernblot)转移,并在80℃烘烤或用长波紫外线照射,将DNA固定在膜上。2、核酸探针的标记。将准备作为探针的DNA片段纯化(这些DNA片段可以是基因组DNA的一个片段,或是cDNA,或是人工合成的寡核昔酸),用放射性元素(如Q一32p)或非放射性元素(如nig一dUTP等)标记,经纯化后再用。3、杂交显示。将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交,洗膜去除未杂交的标记探针后,进行放射自显影或加人酶的底物进行显色反应,再对显示出来的谱带进行分析。1、染色体原位杂交一种基于Southern杂交的分子标记技术。它利用特异性核酸片段作探针,直接同染色体DNA片段杂交,在染色体上显示特异DNA。可采用同位素标记探针,杂交后通过放射自显影显示杂交信号。也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段,杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。2、Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。3、探针化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。用于Southern印迹杂交的探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。探针可以用放射性物质标记或用地高辛标记，放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。人工合成的短寡核苷酸可以用T4多聚核苷酸激酶进行末端标记。探针标记的方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法。五、RFLP的应用用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。遗传病诊断。DNA图谱分析。测定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化进化水平上的差异。用于在不同环境中微生物多样性的研究。动物的遗传育种。