三、质粒与载体

第三章质粒与载体1.质粒概述质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。1.1质粒的分子结构通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；疏螺旋体、链霉菌和酵母菌1.2质粒的检测提取所有胞内DNA后电镜观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；通常用碱裂解法提取质粒1.3质粒的命名第1个字母(小写)：p，质粒（plasmid）;第2，3个字母（大写）：人名，实验室名，表型性状或其他特征的英文缩写;编号（阿拉伯数字）：区别同一类型的不同质粒例：pUC18,pUC191.4质粒的主要类型质粒与宿主的关系：质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。质粒的主要类型（P202）质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子(Fertilityfactor，F因子)抗性因子(Resistancefactor，R因子)产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒(virulenceplasmid)代谢质粒(Metabolicplasmid)隐秘质粒(crypticplasmid)1.5质粒的一般特性•非必要遗传物质一般控制次要性状，能自我复制并稳定遗传。质粒的存在一般也有助于生物在特殊环境下的生长；•在细胞内的大小和数量不相同一般大质粒（分子量60M道尔顿）拷贝数少，小质粒（分子量15M道尔顿）拷贝数较多。氯霉素等可抑制染色体DNA复制而使质粒拷贝数扩增；•互不相容性属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细胞并存；•具有可转移性及稳定性以较高频率（10-6），通过细胞间的接合作用或其它机制从供体转移至受体，在细胞分裂前复制，均等分配至子细胞中；•可整合性在一定条件下，质粒可以整合到染色体DNA上，并可重新脱落下来•可重组性不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细胞外进行交换并形成新的重组质粒；•可消除性经高温、吖啶橙或丝裂霉素C等可以消除质粒，宿主细胞同时也失去质粒所携带的表型性状；•耐碱性与染色体DNA相比，质粒有较高的耐碱性，调pH至12.4，可使染色体DNA变性，通过离心将其与质粒分离2.质粒的复制和调节2.1质粒的大小常见质粒大小的范围为1～200kb，个别大质粒可达800～1000kb质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。1MD的双链DNA≈1.65kb。未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。最精确的测定需要对质粒DNA作序列分析，然后从所含碱基数目来直接推算出其大小和分子量。2.2质粒的拷贝数质粒的数量亦称为质粒在每一细胞中存在的拷贝数(copynumber)不同质粒在细胞中的拷贝数各异。一般而言，质粒的拷贝数与其分子量成反比关系，分子量大的拷贝数低，分子量小的拷贝数高。如F因子这一类质粒，每个细胞中只有1～2个拷贝的质粒，它们的复制受到严格控制，称为严紧型质粒(stringentplasmids)或低拷贝质粒。分子量小的(如ColE1质粒)拷贝数高，每个细胞中有10～100个拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒(relaxedplasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。2.3质粒复制的模型复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子,至少需要有一个复制起点,即ori位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向复制和双向复制两种类型，如R1、R100等的复制是单向的，而F和R6k是双向复制类型。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。而复制所需要的其它蛋白，如DNA聚合酶、连接酶、引物酶、连接酶、RNA-H酶、解旋酶(gyrase)和拓扑异构酶I、dnaB和dnaC基因产物(沿链延伸的DNA合成酶)等都是利用寄主的复制酶体系。复制起点(ori)区的功能•ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点---ori序列附近将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入原核细胞后,该重组DNA具有自主复制能力。pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同来源的DNA片段连接起来而构成的环状质粒：•来源于ColE1的衍生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)及rop区；•来源于质粒pSC101的四环素抗性基因(tetr)；•来源于转座子Tn3的氨卞青霉素抗性基因(ampr)。•ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒如ColE1类型的质粒，包括pBR322、pET和pUC具有较窄的寄主范围，这些质粒只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门氏菌(Salmonella)和克氏杆菌(Klebsiella)中复制。RP4、RK2和RSF1010及从G+细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围(broadhostrange)质粒。广寄主范围的质粒一般是编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。2.4质粒复制的调控•质粒的复制机制同染色体基本相同•质粒的复制的调控主要是控制拷贝数•质粒的复制复制调控机制一般采用直接或间接的负调控机制。•负调控因子可以是蛋白质、RNA或DNA重复序列。抑制物-靶位调控(inhibitor-targetregulation)其特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过它与目标RNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。目标RNA是质粒DNA复制的引物或是用于编码复制所需的Rep蛋白的mRNA。属于这一复制调控类型的质粒包括ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、loDF13、R1等ColE1质粒复制调控ColE1质粒复制调控•6.6kb的小质粒，拷贝数10-20•复制不需要质粒编码蛋白质，而是依赖于宿主的复制酶体系•从一个固定原点oriV开始，进行单向复制。ColE1的复制需要一个RNA引物。RNAⅡ是质粒复制的引物前体,PRNAⅡ是编码RNAⅡ的启动子,RNAⅡ转录是在RNA聚合酶作用下，从复制原点上游方向555bp处起始转录(将RNA与DNA的转换处定为复制原点)。当这个RNAⅡ延伸至复制原点oriV时，由RNAaseH将RNA切断，从而产生3’-OH末端。然后DNA聚合酶以此为引物合成DNA，复制从起始点oriV开始向右进行。3’5’5’3’oriVLorLightstrandHorHeavystrandNewLStrandsynthesisedfirstONLY580bpsneededforplasmidtoreplicateinhostcell-555RNAIIRNAI-445RNAPolymeraseRNAIIstartsat-555onHstrandColE1的复制-445-5553’-445TranscriptionbeyondoriVHybridisationat/nearoriV-5553’3’RNAaseHcleavesatoriV2/3bpaccuracy-445ONLY580bpsneededandONLY13afteroriV质粒编码的两个负调控因子Rop蛋白质和反义RNA(RNAⅠ)，控制了DNA复制过程中所必需的引物的合成。在ColE1复制原点上游方向445bp处(相当于RNAⅡ的第111个碱基的位置)处起始转录另一个RNA分子，其转录方向与RNAⅡ相反，它是由双链DNA链上的另一条链(C-链)为模板进行转录的，这个RNA分子称为RNAI，属于反义RNA。上节课的总结1.原核生物基因组的特点2.质粒及载体1）.质粒的概念及种类2）.质粒复制模型3）.质粒复制的调控抑制物-靶位调控这个反义RNAI有111个碱基与RNAⅡ的5’末端互补，这样,RNAI与RNAⅡ互补形成双链RNA结构,使之不能为RNAaseH所识别(人们通常认为RNAaseH只识别DNA-RNA杂合双链，而不识别双链RNA结构)。RNAⅡ的转录继续进行，不能在分子原点区域产生有活性的引物而对复制起负调控作用。因此，RNAI控制着质粒的拷贝数。这个机理解释了ColE质粒的拷贝数调控,由于RNAI是由质粒编码合成的,当质粒的浓度高时,就会产生较多的RNAI分子,而高浓度的RNAI就会来又干扰RNAⅡ的加工,从而抑制复制。一般当一个细胞中ColE的拷贝数达到16时,就会几乎完全抑制质粒的复制。调控蛋白,rop基因位于ColE1复制原点下游方向不远处。Rop蛋白增强了RNA1和RNA2的相互作用，从而加强了RNAI的抑制作用。反义RNA对质粒复制的抑制作用，控制着质粒的拷贝数，反义基因发生突变将会增进引物的形成和质粒的复制，即增加其拷贝数。野生型ColE1的拷贝数约是20个/每个细胞，当反义基因发生缺陷时，其拷贝数超过250，+600+400-500Rop/RomDimer5’3’5’3’RNAasecut3’oriVSummaryofColE1replicationcontrolRNAIRNAIIR1质粒复制调控R1质粒约90kb，拷贝数为每个细胞1-2个。RepA蛋白是质粒复制起始必需的因子。由repA基因编码，有两个转录启动子，PcopB和PrepA。从PcopB转录产生CopB和RepA两个产物。从PrepA转录仅产生RepA。CopB为PrepA的阻遏蛋白。R1质粒复制区还有copA基因，转录产物为反义RNA，能与repA基因产物RNA互补，形成双链RNA，被RNaseIII降解，RepA无法合成，抑制质粒复制。复制区有tap基因，其产物Tap蛋白为转录活化蛋白，能促进RepA的合成。copBcopAtaprepAoriV5’3’3’5’RepressorRNAIantisenseRNAIIShine-DelgarnorepARepAinitiatesreplicationTap重复子-竞争结合调控(iteron-bindingregulation)最常见于质粒如：F、P1、R6k、RK2、RP4和pSC101等，是通过蛋白质即RepA蛋白进行复制调控。这些质粒在复制的起始位点(ori)和复制基因(rep)附近存在着多个长度为17-22bp的DNA短片段(叫做重复子,iteron)，它们能与复制必需的Rep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。由于含有重复子序列，这些质粒也叫重复子质粒(Iteronplasmids)，通常在ori区有3-7个重复子。除此之外,通常在不远处还有这些重复序列。pSC101是最简单的重复子质粒。pSC101质粒复制调控repA基因编码的RepA蛋白是复制起始所必需的，在ori区有3个重复子序列，R1、R2和R3，RepA就是通过与它们的结合而控制质粒的拷贝数。RepA蛋白是pSC101和许多其它重复子质粒复制所需的唯一由质粒编码的蛋白质。寄主染色体编码的其它蛋白如DnaA,DnaB,DnaC和DnaG与ori区结合后，质粒的复制才起始。第二种调控机理是由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起,从而抑制了质粒复制的起始,这种调控方式被叫做偶联模型(couplingorhandcuffingmodel）。重复子质粒的复制是通过两种机制进行调控的第一,RepA蛋白通过与自身的启动子区的结合而抑制自身的合成,这种调控方式被叫做转录自体调控(transcriptionalautoregulation)。质粒的浓度越高,合成的RepA蛋白就约多,相应地就越多的抑制自身的合成。因此,RepA蛋白的浓度总是维持在一定的范围内,复制的起始受到严格