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实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：放线菌与真菌形态结构观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018年10月16日一、实验目的和要求1.学习并掌握放线菌(链霉菌)，真菌(酵母、霉菌)形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。2.熟练掌握显微镜的使用。二、实验内容和原理1.放线菌放线菌，是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约0.5～1微米。可分为：营养菌丝，又称基内菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。2.真菌[1]酵母菌：为单细胞真核生物。呈圆形、卵形、椭圆形或柠檬型。各体直径比细菌大几倍到几十倍。菌落大而厚，湿润光华，颜色多为乳白色、灰白色、似细菌落。繁殖方式包含无性繁殖(芽殖或裂殖)与有性繁殖(形成子囊与子囊孢子)。[2]酵母菌的出芽生殖：在细胞的一端初生小突起，如芽状，逐渐增大。细胞核一分为二，其中一个进入小突起，经细胞壁缢缩。芽体与母细胞脱离，形成新个体。若芽体不脱离母体而有继续生出新芽，而芽细胞聚集形成芽簇，芽簇细胞伸长呈丝状或藕节状，称做假菌丝。[3]美兰染色法：美兰是一种无毒性染料，氧化型呈蓝色，还原型呈无色。活细胞具有较强还原能力，使美兰由蓝色变成无色。染色后，酵母活细胞无色，死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞呈蓝色或淡蓝色。[4]酵母菌肝糖粒碘液染色：肝糖粒是酵母细胞的内含物，属于碳源及能源性贮藏物。用碘液染色，菌体呈淡黄色，肝糖粒呈红褐色。[5]霉菌：由菌丝体构成，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝长到一定阶段分化产生繁殖菌丝。由繁殖菌丝产生孢子。菌丝和孢子的宽度比细菌和放线菌大几倍到几十倍。制片时滴加乳酚油，防止干燥，可保持菌丝体原形。[6]黄曲霉：唯一种常见的腐生真菌，多见于发霉的粮食、蔬菜及水果。形态上有明显的分生孢子结构，分生孢子梗从足细胞上生长出来，往上延伸膨大呈顶囊，顶部有一至二层结构，分别为出生小梗及次生小梗。回曲霉在成熟时还可以产生黄曲霉毒素，为黄曲霉的剧毒代谢产物，为强致癌物。[7]青霉：唯一种常见的腐生植物，多见于发霉的粮食、蔬果。形态上具有帚状的分生孢子(包含包生孢子梗、梗基、小梗、分生孢子)。青霉常被应用于有机酸及抗生素的生产。[8]黑根霉：亦称面包需或匐枝根霉，常出现于发霉的面包、米饭等食物上，瓜果腐烂。出现黑斑与具有关。具有匍匐菌丝、假根、包囊梗、孢了囊、包囊孢子。黑根霉常用于果胶酶、淀粉酶的生产。黑根霉的接合孢子是黑根霉的一种有性孢子，使由两条不同性别的菌丝特化后形成配子囊，配子囊接合后形成接合孢子。三、主要仪器试剂（必填）1.菌种：链霉菌5天板培养物、黄曲霉4~5天平板培养物、青霉4~5天平板培养物、黑根霉7天平板培养物、啤酒酵母2天培养物2.示范片:黑根霉及其接合孢子3.仪器及相关用品:乳酚油、碘液、0.1%美兰、50%酒精、蒸馏水、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、解剖刀、酒精灯、显微镜、镜头油、擦镜纸、吸水纸、镜头洗液。四、操作方法和实验步骤1.放线菌形态结构的观察：个体形态直接观察法:观察青色链霉菌菌丝和孢子丝自然生长的性状，包括气生菌丝(粗、亮)，基内菌丝(细、暗)和孢子丝的形状，如分枝状况及孢子丝卷曲等。印片染色法:微热载玻片印片→过火固定→石炭酸复红染色→lmin水洗→干燥→镜检(高倍镜和油镜)→绘图说明。2.酵母菌形态观察:美兰染色法：(1)先在载玻片上加一小滴美兰染色液，用接种环挑取一环酵母菌液，与载玻片，上的美兰染色液充分混匀，盖上盖玻片。(2)将制片放置约3min，先低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。肝糖染色法；(1)先在载玻片，上加一小滴碘液，用接种环挑取一环酵母菌液，与载玻片上的碘液充分混匀，盖上盖玻片后镜检。(2)在高倍镜下观察菌体形态、出芽、芽簇、肝糖粒，通常菌体呈淡黄色，肝糖粒呈红褐色，并绘图。3.黄曲霉的形态观察:观察黄曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况，着重辨认分生孢子梗、顶囊、小梗、分生孢子、足细胞等。(1)无菌操作用解剖针挑取或镊子夹取少许黄曲霉培养物(菌丝并略带少量培养基)，置于洁净的载玻片上，加酒精和蒸馏水各一滴，重复一次，使分生孢子分散，便于观察。(2)倾去酒精和蒸馏水，加一滴乳酚油，防止细胞变形或干燥，盖上盖玻片(适当用手指压实、除气泡)低、中、高倍镜观察，绘图。4.青霉的形态观察:制作青霉标本片，着重辨认帚状体(分生孢了梗、小梗、分生跑了)，并绘图。5.黑根霉的形态观察:观察黑根霉示范镜。辨认包囊胞子、孢子囊、孢囊梗、匍匐菌丝假恨，并绘图。6.黑根霉接合抱了的形态观察：观察黑根霉接合孢了示范片，并绘图。五、实验结果与分析观察结果链霉菌放大100*10(油镜)酵母菌(美兰染色)放大100*10酵母菌(碘液染色)放大100*10观察到的为链霉菌的气生菌丝形成长链状的孢子丝，经复红染色后呈粉紫色，其长链是由多个杆状的孢子相连构成。经美蓝染色后有少部份的酵母菌呈深蓝色，为死亡或代谢功能较弱的细胞，呈无色透明的则是代谢正常的活细胞，使美蓝染液还原成无色。观察活细胞可以看到其细胞内有一小区颜色较浅，推测应为其细胞代谢旺盛的区域。经碘液染色后酵母菌细胞呈淡黄色，其中有些细胞内有深褐色的结构，为酵母菌中的肝糖粒。同时经过染色后可以观察到酵母菌的芽殖，与芽簇结构。青霉放大100*10黄曲霉放大100*10黑根霉放大100*10青霉菌在高倍镜下可以在其边缘部份找到呈帚状的分生孢子(帚状体)，其分生孢子梗上分叉出多个梗基，上接分生小梗，顶部为分生孢子。黄曲霉菌在高倍镜下可以看到其向爆炸头一样的分生孢子结构，其分生孢子顶端膨大呈顶囊，上头有1~2层分生孢子结构，一层的为初生小梗，两层的为初生小黑根霉的孢子梗为立体构型，用显为镜观察时需不断调节粗调节轮，最顶部的为黑色球形的孢子囊，下接孢囊梗，最底部可以看到爪状的假根。梗加次生小梗。黑根霉接合孢子放大100*10黄曲霉(足细胞)放大100*10可以看到结合孢子由两根粗细相仿的菌丝结合而成，接何处膨大呈球状。黄曲霉的足细胞呈倒T字型，细胞无横隔，上接分生孢子梗。链霉菌放大100*10(油镜)酵母菌(美兰染色)放大100*10酵母菌(碘液染色)放大100*10青霉放大100*10黄曲霉放大100*10黑根霉放大40*10黑根霉接合孢子放大100*10黄曲霉(足细胞)放大100*10六、讨论、心得这次的实验分别观察了属于放线菌的链霉菌与属于真菌的酵母菌、黄曲霉菌、青霉菌与黑根霉菌。并着重观察其生殖结构，如用于无性生殖的酵母菌进行芽殖产生的芽胞子、黄曲霉与青霉的分生孢子，与用于有性生殖的结合胞子与孢囊孢子对我们了解真菌与放线菌的生殖构造十分有用。同时透过观察我们也可以知道个已知道个结构的比例，并了解了各种微生物的观察方法。七、思考题1.放线菌、酵母菌、细菌在细胞形态与结构上有何区别?在细胞形态上细菌的形态简单，基本有球状，杆状，螺旋状三类，仅少数为其他形状，如丝状，三角形，方形，圆盘形等，度量细菌的单位为微米(0.5~5微米)，而度量其亚细胞结构要用纳米，细菌包括细胞壁，细胞膜，细胞质和核有的区，有的含有特殊构造，如鞭毛，菌毛等。而酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍，细胞形态通常有球状，卵圆状，椭圆状，柱状。酵母菌的细胞膜由三层结构组成，主要成分为蛋白质，类脂，和少量糖类，酵母菌有由多孔核膜包裹起来的定形细胞核。放线菌是丝状细菌，宽度大致等同于杆状细菌之宽，约0.5~1微米需要油镜(100倍物镜)，才能看清楚轮廓，看不到细胞内部结构。在菌落特征上，细菌菌落一般呈现湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。放线菌与细菌有明显差别在于菌落干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一层彩色的“干粉”；酵母菌菌落与细菌相仿，呈现湿润、较透明，表面较光滑、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等特点。2.制取霉菌水浸片时为什么用乳酚油?可以霉使霉菌干燥，并保持其构型。3.真菌丝和假菌丝有什么区别?假菌丝(pseudohypha)是指酵母菌菌种进行一连串的芽殖后，长大的子细胞仍不脱落分离，并继续出芽，细胞成串排列，在分隔处缢缩，这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。假菌丝的各细胞间仅以狭小的面积相连，呈藕节状。真菌丝(truehypha)是指菌丝顶端连续生长产生隔膜形成的菌丝，隔膜处不缢缩。即相连细胞间的横隔面积与细胞直径一致，呈竹节状的细胞串。而假菌丝与真菌丝明显不同处在于其两细胞间有一细腰，而不象真正菌丝横隔处两细胞宽度一致。4.霉菌的无性孢子和有性孢子各有几种?它们是怎样形成的?霉菌的无性孢子直接由生殖菌丝的分化而形成，常见的有芽孢子、节孢子、厚垣孢子、孢囊孢子和分生孢子。（1）芽孢子：芽孢子和酵母菌的出芽一样，是由母细胞生芽而形成的。当芽长到正常大小时，脱离母细胞，或仍连在母细胞上，如玉蜀黑粉菌能产生芽孢子。某些毛霉或根霉在液体培养基中形成的“酵母型细胞”，也属芽孢子。（2）节孢子：某些真菌生长到一定阶段，菌丝中间形成许多隔膜，接着从隔膜处断裂成许多竹节似的无性孢子，称为节孢子，也称为粉孢子。最典型的例子是白地霉。（3）厚垣孢子：厚垣孢子又称厚壁孢子或厚膜孢子。某些真菌生长到一定阶段，在菌丝的顶端或中间有部分细胞的细胞质密集在一起，变圆，然后在其四周生出厚壁，或原细胞壁加厚，形成圆形、纺锤形的无性休眠体，来抵抗外界不良的环境条件，如总状毛霉常在菌丝中间形成许多厚垣孢子。（4）孢囊孢子：无性繁殖产生的孢子在孢子囊内，称为孢囊孢子。孢子囊一般生在气生菌丝的顶端或生在孢囊梗的顶端。在形成孢子囊前，首先有多核的原生质密集于此处，使其膨大，并在下方生出横隔，形成圆形的囊状物，然后其中原生质体割裂成许多小块，每一块发育成为一个孢囊孢子。因而每一个孢子囊所含有的孢囊孢子的数目一般都相当多。就孢囊孢子而言，一般有两种类型。一种具有一根或二根鞭毛，能够游动，所以称游动孢子，如腐霉。另一种无鞭毛，不能游动，又称静止孢子，毛霉目的孢囊孢子即属此类（5）分生孢子：分生孢子是真菌中最常见的一类无性孢子。有的生在气生菌丝或分支的顶端，有的生在分生孢子梗的顶端或侧面。其形成方式有两种：一种是在分生孢子梗的顶端突出，发育成第一个孢子。梗再伸长形成第二个孢子，如此重复，形成一串孢子。这样形成的分生孢子，顶端的最老。曲霉属和青霉属的分生孢子形成，即属于此类型。另一种是在第一个分生孢子形成时，柄的长度已达到最高，由第一个分生孢子顶端生长出第二个分生孢子，如此重复形成一串孢子。这样形成的分生孢子，下部的最老，如枝孢霉属的分生孢子形成即属于此类型。有些霉菌，两条菌丝可直接结合，多数霉菌则由配子囊（由菌丝分化形成的性细胞）或配子（由配子囊产生）相互交配，形成有性孢子，主要类型有：接合孢子、卵孢子、子囊孢子。（1）接合孢子：接合孢子是由菌丝生出的结构基本相似,形态相同或略有不同的两个配子囊接合而成。首先，两个菌体各自向对方伸出极短的特殊菌丝，称为接合子梗。性质协调的两个接合子梗成对地相互吸引，并在它们的顶部融合形成融合膜。两个接合子梗的顶端膨大，形成原配子囊。而后，在靠近每个配子囊的顶端形成一个隔膜--配了囊隔膜，使二者都分隔成两个细胞，即一个顶生的配子囊柄细胞，随后融合膜消解，两个配子囊发生质配，最后核配。（2）卵孢子：由大小不同的配子囊结合发育而成，小配子囊称雄气，大配子囊称藏卵器。（3）子囊孢子：两个单核而且是单倍体的营养细胞结合后，经质配、核配而成为一个二倍体的细胞。这种二倍体细胞在一定条件下，其细胞核进行两次分裂，其中一次为减数分裂。因而变成含四个子核的细胞，此时的细胞即成为子囊，四个子核与周围的原生质各形成一个孢子，即子囊孢子。