液相色谱基础知识及方法开发..

LOGO液相色谱基础及方法开发2013年5月7日主要内容液相色谱方法开发实例3.液相色谱方法开发过程2.液相色谱基础知识1.一液相色谱基础知识液相色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术移动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相-色谱柱色谱分离的机理色谱是一种分离技术色谱分离是一个物理过程流动相（MobilePhas）固定相（StationaryPhase）样品（溶解于流动相中的溶质）液相色谱分离机理高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速分配和高效分离的柱液体色谱方法。样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移速率的微小差异。随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最终达到组分完全分离。液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器泵输液分离柱检测器记录AEGBCDF进样阀进样HPLC的仪器配置色谱泵色谱柱及柱温箱检测器数据处理系统溶剂自动进样器液相色谱图相关术语色谱图(chromatogram)—样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)—经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)—基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)—基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。峰底—基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peakheight，h)—峰的最高点至峰底的距离。u峰面积(peakarea，A)—峰与峰底所包围的面积。液相色谱图相关术语色谱峰(peak)—组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。拖尾因子(tailingfactor，T)—是用以衡量色谱峰的对称性，也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。峰宽(peakwidth，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽(peakwidthathalf-height，Wh/2)—峰高一半处的峰宽。标准偏差(standarddeviation，σ)—正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。液相色谱图相关参数♦定性参数（保留值）♦柱效参数♦相平衡参数—容量因子k—选择性因子a♦分离参数定性参数（保留值）♦死时间(deadtime，t0)—不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。♦死体积(deadvolume，V0)—由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。V0＝F×t0（F为流速）♦保留时间(retentiontime，tR)—从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。♦保留体积(retentionvolume，VR)—从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F×tR。♦调整保留时间(adjustedretentiontime，t'R)—扣除死时间后的保留时间。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0♦调整保留体积(adjustedretentionvolume，V'R)—扣除死体积后的保留体积。V'R＝VR－V0或V'R＝F×t'R柱效参数理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)—用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）221654.52WtNRWthR相平衡参数容量因子(capacityfactor，k)—化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。性质-与柱子的大小及流速无关,只与溶质在固定相和流动相的分配性、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体积比）有关。范围0.4＜k＜20～30溶质在流动相中的量溶质在固定相中的量或k00tttkR相平衡参数1,2,1,2,kkttaRR选择性因子(selectivityfactor，α)—相邻两组分的分配系数或容量因子之比。要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。1,2,1,2,kkttaRR分离参数分离度(resolution，R)—相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。121221wwttR分离参数基本分离方程—影响分离度的因素很多，但可慨刮为三个基本项,(a)柱效项。(b)柱选择性项(c)柱容量因子项。即：从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及pH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内，最好为2~5。二液相色谱方法开发过程1.得到样品信息，确定分离目标2.确定特定的液相过程、样品预处理等需求3.选择合适的检测器4.初步分离，优化分离条件5.检测特定过程的问题及需求，优化分离条件检测器种类—紫外吸收♦紫外吸收检测器♦光电二极管阵列检测器—荧光—示差折光—化学发光紫外吸收检测器紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽(190nm～800nm)。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。色谱基本分类色谱基本分类：按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为：1.分配色谱—分配系数2.亲和色谱—亲和力3.吸附色谱—吸附力4.离子交换色谱—离子交换能力5.凝胶色谱（体积排阻色谱）—分子大小引起的体积排阻分配色谱分配色谱分为：正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性。反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性，极性高的先被洗脱，用得最多，约占60-70%。相对应的色谱柱：反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS）、C8、C4、C3、苯基等。正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基，-NH2氨基等。分配色谱的分离机理流动相极性流动相洗脱强度反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：水甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇方法开发的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k’值改变保留值调节a值改变选择性•通过改变流动相的pH值，使样品成中性•加入“对离子”，使样品呈中性调节柱长度改变柱效及分离速度请记住∶每次改变一个参数三液相色谱方法开发实例实例一：色谱条件∶•色谱柱：C18，4.6mm×150mm•流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度）举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱•流速：1ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)1.改变容量因子K’60/4050/5040/60①②③①②②③③①谱图①②③62:38/42:58/72:28/2322＝③＝②＝①OHCNCHOHMeOHOHTHF2.调节α值改变选择性同样强度的不同溶剂，改变了流动相α值改变色谱柱液相色谱方法开发实例实例二（正相系统）色谱条件：流动相：正己烷（含三氟乙酸0.1%）：异丙醇=70：305.010.015.020.025.030.035.040.045.0min-7.5-5.0-2.50.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5mV检测器A:220nm19.212/72706720.626/30263137.216/14660969峰#保留时间面积面积%分离度理论塔板#拖尾因子高度119.2127270674.6338--1774.29--11026220.6263026311.92870.873350.758--6203337.2161466096993.43758.0333028.1371.275139886液相色谱方法开发实例流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸=80：20：0.1010203040506070min-60-50-40-30-20-1001020304050mV检测器A:220nm26.040/79789028.655/29824063.120/14071065峰#保留时间面积面积%分离度理论塔板#拖尾因子高度126.047978905.2606--1826.184--8917228.6552982401.96631.2233879.604--4148363.121407106592.77310.5812917.9551.34278202液相色谱方法开发实例流动相：正己烷：（异丙醇：乙醇=70：30）三氟乙酸=72：28：0.110.012.515.017.520.022.525.027.5min-1001020304050mV0102030MPaA.压力(状态)检测器A:220nm17.603/18178819.027/9165026.653/37019475峰#保留时间面积面积%分离度理论塔板拖尾因子117.6031817880.4875--5009.0571.207219.027916500.24581.5488102.8101.147326.6533701947599.266