DNA提取方法(二)

1、真核细胞DNA的制备一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：1、防止和抑制DNase对DNA的降解。2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。试剂准备：1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。4、20%SDS5、2mg/ml蛋白酶K6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿7、无水乙醇、75%乙醇试验步骤：材料处理：1、新鲜或冰冻组织处理：1)取组织块0.3-0.5cm3剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。4)60C水浴1-3hr。2、培养细胞处理：1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。2)离心4000g5min，去除上清液。3)加10倍体积的裂解缓冲液。4)50-55C水浴1-2hr。DNA提取：1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。2、离心5000g10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g10min，取上层水相到另一管中。6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。7、待絮状物出现后，离心5000g5min，弃上清液。8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g3min，弃上清液。9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。2、细菌DNA的提取方法针对一些不易于提取的细菌的方法:试验试剂：抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl10MliCl2MliClDEPC-water（抑制RNA酶活性）3MNaAc(pH5.2)96%乙醇70%乙醇试验步骤：1、抽提缓冲液65℃预热。2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12000rpm，离心10min。4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12000rpm，离心10min。5、重复再作一次步骤4。6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。7、以2000rpm，离心10min。8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。3、较为常用的细菌DNA提取方法：实验步骤：1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.4、加入100ul5mol/LNaCl充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．4、真菌DNA提取总结的两种方法：第一种方法：试验步骤：1、取真菌菌丝0.5g在液氮中迅速研磨成粉。2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。4、以4℃，1000rpm，离心5min。5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10000rpm，离心5min。6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀混匀静置约30min。7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc2.5倍体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。第二种方法：试验步骤：1、真菌菌丝0.5-1g在液氮中迅速研磨成粉。2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min期间混匀2-3次。3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10000rpm，4℃离心5min）。5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇混匀静置约30min。6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀用75%乙醇反复漂洗数次再用无水乙醇漂洗1次吹干，重悬于500ulTE中。7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10000rpm，离心5min。9、取上清，1/10V3MNaAc2.5V体积的无水乙醇-70℃沉淀30min以上。10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干溶于200ulTE中，-20℃保存备用。5、石蜡包埋DNA提取试验方法试验原理：从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。试验试剂：配方：3mol/lNacl，0.3M柠檬酸三钠2H2O，用HCL调PH值至7。0石蜡消化液：150nmol/lNacL：15mmol/l柠檬酸钠，1%SDS，PH7.0。试验步骤：1、取蜡块切片15-20张（8μm），置于eppendorf管中，加入1ml的二甲苯，37℃作用3h，以10000rpm，离心3min，倾去二甲苯。重复3-4次，观察管壁是否光滑。如果仍有蜡质残存，需继续脱蜡。2、剃度酒精水化：加入100%乙醇1ml，室温下放置30min，以10000rpm离心3min，去上清；再依次分别加入95%；75%；50%的乙醇重复上面的步骤。