DNA提取-

实验三：DNA提取及PCR反应蒋建伟第一部分：DNA提取一、DNA提取的基本步骤三、DNA提取常见问题与对策二、DNA提取注意事项一、DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中DNA提取（一）样品准备：1、组织：①3g组织，用8层纱布包好，再包多层牛皮纸，浸入液氮，取出，用木锤敲碎。②碎组织放入搪瓷钵中，加少量液氮，碾磨至粉末状。③在50ml离心管中，加10mlDNA提取液，用玻棒边搅动液体，边加入组织粉末，37℃混匀。2、组织，3g，-70℃保存，临用时用玻璃匀浆器，用DNA提取液将组织磨成匀浆。注：DNA提取液见p-8或p-11,下同。（一）样品准备3、培养细胞消化收集细胞，PBS洗3次，加10mlDNA提取液，混匀。4、血液①取血液离心，取淡黄色白细胞层，加NS，离心。或者加D2.H2O，离心，收集白细胞。②加10mlDNA提取液，37℃mix。（一）样品准备（二）提DNA酚抽提法：①加RNase，37℃1h，②加蛋白酶K，50℃，3h；或37℃12h,不时mix③加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。④加等体积酚，充分mix，9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。⑤氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次。9000rpm，3min，小心吸取上层粘稠水相。⑥移到50ml烧杯中，加2.5倍体积冷无水乙醇，用玻棒钩出DNA。⑦TE溶解。2、异丙醇沉淀法：原理：用2倍体积异丙醇沉淀DNA溶液，DNA沉淀是丝状，而RNA溶于异丙醇中，可除去RNA。①细胞，PBS洗2次。②3mlTEN重悬，加DNA提取液，蛋白酶K，50℃1～4h③加等体积饱和酚，混匀，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。④氯仿-异戊醇(24:1)抽提1次，9000rpm3min，小心吸取上层粘稠水相。⑤加2倍体积的异丙醇，用玻棒钩出DNA。⑥TE溶解。（二）提DNASDS法-提取DNASDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取缓冲液小结SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法CTAB法CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。举例CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA－CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。基因组DNA－CTAB法CTAB法流程图：植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液二、DNA提取注意事项1.材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取注意事项2.细胞裂解适量。过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取注意事项3.核酸分离、纯化：采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔。离心分离两相时，应保证一定的转速和时间。针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法。基因组DNA的提取注意事项蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2,v/v)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。注意事项多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤注意事项4.核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分。沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀。沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等。晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）。若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase。pH值为8.0，可防止DNA发生酸解。基因组DNA的提取注意事项三、DNA提取常见问题与对策1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因对策DNA提取常见问题与对策1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。问题二：DNA降解。对策原因DNA提取常见问题与对策1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料。2.动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。4.低温沉淀，延长沉淀时间。5.加辅助物，促进沉淀。6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒。DNA提取常见问题与对策问题三：DNA提取量少。对策原因第二节PCR反应一、PCR反应原理和反应过程二、PCR标准反应体系：三、PCR的反应条件（反应参数）四、PCR常见问题与对策五、PCR衍生技术（略）多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)KaryB.MullisPCR是由美国科学家Mullis提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：•变性（denaturation）:94C~95C•退火（annealing）:40C~70C•延伸（extension）:72C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)40506070809010010080604020耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。PCR反应循环72℃94℃55℃PCR循环变性退火延伸PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火二、PCR标准反应体系：•DNA模板•引物•反应缓冲液•dNTP•ddH2O•耐热聚合酶1模板①单、双链DNA均可。注意模板的完整性，模板降解会导致PCR扩增无产物。②不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。③蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应。④RNA作为模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为扩增的模板。⑤DNA模板一般100ng/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。2、引物（Primers)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。。•是化学合成的寡核苷酸，•能与模板特异地结合，•引物决定PCR产物的特异性和长度。引物设计的原则（一）①引物长度：15-30bp，常用为20mer左右.–引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜。引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+4（C+G）。Tm在55-65℃最好。–G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。–ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。–引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在5℃之内。引物设计的原则（二）④避免引物内部出现二级结构–避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带。⑤引物3’端的碱基要求严格配对–特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点•引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制，引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）。引物设计的原则（三）⑦引物的特异性：序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。⑧引物量：引物浓度：0.1~0.2umol/L，浓度过高容易生成引物二聚体，过低则扩增产物减少。其他：•避免反复冻融。•RT-PCR引物设计特别注意：跨越两个外显子。3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。dNTP呈颗粒状，酸性，使用时应配成高浓度后，以1MTris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为20～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低