微生物菌种-高通量筛选技术-与装置

华东理工大学国家生化工程技术研究中心(上海)王永红2011.11.24微生物菌种高通量筛选技术与装置内容提纲高通量筛选在微生物育种中的重要意义菌种高通量筛选技术与装备国际进展高通量筛选技术应用示范高通量筛选在微生物育种中的重要意义1、菌种是发酵技术的源头2、菌种是发酵技术的核心之核心3、菌种提高不增加设备材料投入菌种发酵水平是企业产品市场竞争力的体现青霉素：5万——12万u/ml（国内）8万——20万u/ml（国外）红霉素：5000——8000/10000u/ml（国内）10000——15000u/ml（国外）阿维菌素：4000——8400u/ml（国内）10000u/ml以上（国外）案例育种工作中两大任务：突变与筛选高通量筛选在微生物育种中的重要意义变异菌种库筛选目标株自然选育人工诱变推理选育杂交育种基因工程代谢工程各种组学系统生物学合成生物学特异性模型筛选量突变仅是前提筛选才是关键我国现有菌种筛选仪器装备与技术国际相比存在巨大差距我国：传统方法，筛选方式半个世纪没有明显改进国际：高通量筛选技术(Highthroughputscreening,HTS)高通量筛选在微生物育种中的重要意义TraditionalscreeningHighthroughputscreeningFlask/tube(single)Microtiterplate(12、24、48、96、384、1536)Volume(10-50ml)Volume(10-500μl)Screen20-50/week/labScreen1000-10000/week/labManualAutomaticLaboriousLaborsavingSeriesParallel内容提纲高通量筛选在微生物育种中的重要意义菌种高通量筛选技术与装备国际进展高通量筛选技术应用示范1929，1940s-1950sPfizer公司：土霉素的发现56名科学家、10万份土样、历时1年25%市场1984年，Pfizer提出AutomationProject.1990年，在Nagoya,Japan实施1万株份/周高通量筛选技术的起源微生物菌种筛选一般流程概率事件菌种高通量筛选技术与装备国际进展通量限制步骤诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛验证工业应用接种到多孔板倒平板培养基保藏活化前处理检测出发菌株微生物菌种筛选仪器装备发展趋势：自动化、微型化、高通量•培养基灭菌、分装；倒平板；挑取单菌落、接种；培养；目的产物抽提；测定；数据收集处理等过程•单元自动化与系统集成自动化（通量匹配）菌种高通量筛选技术与装备国际进展FillingUnit分装速率：400-1200dishes/h分装量：4-45ml/0.5-0.6sec平动规格：直径92-98mm可调高度15-21mm可调灭菌方式：253.7nm紫外线灭菌尺寸重量：45cm(L)*30cm(D)*61cm(H),15kg★StackingUnit堆叠速率：可调，与输送机自动配合。堆叠高度：2-15板平皿，可调堆叠桌面：500´500mm可扩充尺寸重量：81cm(L)*49cm(D)*45cm(H),13kg诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛验证工业应用接种到多孔板倒平板培养基保藏活化前处理检测出发菌株全自动培养基分装系统750皿/小时自动灭菌培养基制备机出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测自动细菌平板稀释仪4600个克隆/小时诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛验证工业应用接种到多孔板倒平板培养基保藏活化前处理检测出发菌株培养出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛工艺放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测培养基分装传统方法诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛验证工业应用接种到多孔板倒平板培养基保藏活化前处理检测出发菌株高通量方法：96、384、1536/min传统方法：1-2/min（分光光度计）1/15-30min（HPLC）传统方法出发株诱变等10倍稀释涂平板单菌落初筛复筛验证放大接种倒平板培养基保藏活化前处理检测培养基分装1微孔板式反应器2微流控式芯片实验室3摇瓶形式的微型反应器1232056valves,256compartmentscontainingbacterialexpressinganenzyme24个，5ml12个，30ml24个，1ml多通道多参数微型反应器动物细胞培养用微型反应器左图4.9×2.3×2.2m，整个箱体有温湿度控制，箱体内，条形码阅读器、盖板站、封板器、液体处理装置、摇床、光度计、离心机、冷藏室等。平行地实现样品准备、运行、监控768个（16个48孔板）。系统集成自动化：四个层次Orbitor工作站重量轻only55lbs.只有25公斤高可靠性Collisiondetection&recovery冲突检测与恢复Platesensinginthegripper微孔板传感器Servogripper–doesnotdropaplatewhenthepowergoesout!伺服抓板手-即使停电也不会让一个板子掉落运送一块板子只需4秒钟Bi-directionaltelescopingarm双向伸缩手Unlimited3600rotation无限360度转动Nohardstops无急停死角Motionblending运动混合smoothmovements平稳移动Orbitor结构剖解1.Bi-directionaltelescopingarm双向伸缩抓板手2.Rotatingbase旋转平台3.Internalre-grip内部固定装置4.Hotelmountx4板子堆栈*41.4.3.2.操作灵活性PCdriven微机控制Nocontrollerrequired无需其它控制装置Add-onstoragecapability可搭配存储能力Smallfootprint小的占地空间和轨迹Feedupto4instrumentswithease可连接4台仪器Fitswithinawidevarietyofbiosafetycabinets适应多种型号的生物安全柜内容提纲高通量筛选在微生物育种中的重要意义菌种高通量筛选技术国际进展高通量筛选技术应用示范高通量筛选技术ScaleupScaledown微型化高通量标准化对高通量筛选技术存在认识上的误区认为微型化只要按比例缩小即可，忽略参数相关性问题；对操作条件的平行性没有足够的认识仅注重培养环节高通量，忽略其他步骤匹配和瓶颈的转移问题对标准化重于最优化的认识不足高通量筛选是提高成功几率的一种技术手段菌种高通量筛选技术组成高通量前处理技术高通量培养技术高通量液体处理技术高通量转接种技术高通量克隆制备技术菌种库管理技术高通量数据管理技术高通量分析检测技术菌种高通量筛选技术分析测试高通量培养菌种资源菌种高通量筛选技术通量匹配限制瓶颈在不断克服和转移菌种高通量筛选技术菌种高通量筛选技术是一整套高通量技术的有机整合和合理匹配红霉素生产菌株的微型化培养及分析菌落库孔板培养离心移液检测高通量微型化培养就摇瓶与微孔板之间的生理发酵参数和动力学参数进行了研究，以证实微型化培养方法的可行性，为红霉素产生菌高通量筛选奠定了基础。微型化培养--动力学参数比较t1t2t3t4t5t6摇瓶30〞31〞2829〞2034〞2237〞28〞3012孔板(2.5ml)8〞978〞618〞599〞119〞328〞87摇瓶12孔微孔板kLa（h-1）105．288．42.1氧气传递系数2.2物料混合流场特性OTR与混合三、国家生化工程中心的高通量筛选工作基础微型化培养--发酵参数比较02004006008001000120014001600180012345周期(d)生物效价(u/ml)摇瓶培养微型化培养2.3生物效价012345612345周期(d)总糖值(g/100ml)摇瓶培养微型化培养2.4总糖的对应性实验微型化培养--发酵参数比较00.511.522.512345周期(d)还原糖值(g/100ml)摇瓶培养微型化培养2.5还原糖的对应性实验00.0050.010.0150.020.0250.031224364860728496108120132144时间(h)生物量(g/ml)微型化培养摇瓶培养2.6生物量微型化培养--装置图种子（挖块）发酵（孔径2cm）微型化分析建立与微型化发酵培养配套的检测方法，才能真正意义上实现筛选的高通量。生物检测法化学检测法生物检测法生物检定法又分管碟法和比浊法两种，管碟法是最常用的生物检定法，也是我国2005版之前药典收录的唯一一种微生物检定法。与管碟法比较，比浊法具有快速(检验仅需3～4h)、易于操作、采用液体培养法、无扩散因素影响、灵敏度高和精密度较好等优点，适用于绝大部分抗生素和含抗生素样品的含量测定。化学检测法红霉素分子在酸性条件下水解生成黄色络合物，此颜色与含量成正比，符合朗格尔比色定律。红霉素检测方法微型化分析--生物检测法微量比浊法测定红霉素生物效价的可行性0100020003000400050006000123456周期(d)生物效价(u/ml)管碟法化学法常规比浊法微量比浊法微型化分析--生物检测法A9A9A9A9A4A4A4A4E3E3E3E3A7A7A7A7A8A8A8A8E1E1E1E10500100015002000250030003500管碟法化学法常规比浊法微量比浊法生物效价(u/ml)微型化分析--生物检测法123456789101112A0.3300.3310.3310.3300.3310.3300.3310.3320.3310.3310.3310.330B0.3320.3330.3330.3320.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3320.332C0.3310.3320.3320.3320.3320.3320.3330.3330.3320.3320.3320.331D0.3320.3330.3340.3330.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3330.332E0.3320.3330.3330.3330.3330.3330.3340.3330.3330.3340.3330.332F0.3330.3340.3340.3340.3330.3330.3340.3360.3340.3330.3330.333G0.3330.3330.3340.3340.3330.3330.3340.3340.3340.3340.3340.333H0.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.3330.333准确度：1.5%精密度：0.005相对标准偏差(RSD)：1.48%检验96孔板的准确度与精密度微型化分析--化学检测法05001000150020002500300035004000450012345678化学效价（U/ml）发酵批次752分光光度计酶标仪红霉素化学效价测定结果比较微型化分析--化学检测法样品前处理对红霉素效价检测的影响分析微型化分析--化学检测法00.10.20.30.40.50.60.70.8050100150吸光值化学效价(u/ml)samplesandstandardsamples高通量化学检测方法验证标准品加入法是在样品溶液中加入一系列梯度标准溶液进行显色测定，然后按照绘制标准曲线的步骤测定吸光度,绘制吸光度-加入浓度曲线,用外推法求得样品溶液的浓度。两条直线切入横座标上所间的距离，即是样品中红霉素的化学效价，为47.8μ/ml，标准曲线法测定的结果为48.02μ/ml，相对标准偏差为0.00324Y1=0.0046X-0.0164Y2=0.0046X+0.2202高通量（微型