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.’.部门职务/岗位签名日期起草质量控制室化验员技术审核质量控制室主任法规符合性审核质量保证室质量运行岗文件格式审核质量保证室文件管理员批准质量管理部经理生效日期年月日颁发部门质量管理部复审日期年月日文件拷贝号分发部门质量管理部设备部物资部总经理办公室质量保证室销售部生产部车间质量控制室.’.●大肠埃希菌检查SOP1.目的建立一个规程，规范大肠埃希菌计数操作方法。2.范围本规程适用于xxxxxxxxxx公司质量控制室对水质、碳酸钙成品及其他的微生物限度检查。3.职责QC检测人员负责按照本规程进行样品检测和记录；QC负责人及监管人员有权对检测过程及结果进行监督检查，有权制止不符合规程的操作并向QA提出重试请求，得到QA批准后方可进行重试。必须开启偏差记录来解决不符合规程的操作。4.物料和设备4.1试剂和材料pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。胰酪大豆胨液体培养基：胰酪胨17.0g氯化钠5.0g大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氢二钾2.5g以上成分混合加水1000ml，微温溶解，滤过，调节PH使灭菌后在25℃的pH为7.3±0.2，加入无水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分装，灭菌。20~25℃培养3～5天后无菌生长即可使用。胰酪大豆胨琼脂培养基：胨10.0g氯化钠5.0g牛肉浸出粉3.0g水1000ml葡萄糖5.Og除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇勻，滤清，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。麦康凯液体培养基明胶胰酶水解物20.0g溴甲酚紫10mg乳糖10.0g水1000ml牛胆盐5.0g除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。麦康凯琼脂培养基明胶胰酶水解物17.0g中性红30.0mg胨3.0g结晶紫1mg乳糖10.0g琼脂13.5g脱氧胆酸钠1.5g水1000ml氯化钠5.0g除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2，加入乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸1分钟，并不断振摇，分装，灭菌。市售成品培养基按说明书配制。革兰氏染色试剂：有商品供应，含结晶紫染剂、碘液固染剂、酒精脱色剂、复红复染剂。4.2器材和设备无菌器皿：吸管、量筒、锥形瓶或盐水瓶等。其它器材和设备：接种针、酒精灯、玻片、细菌培养箱等。.’.5程序5.1样品处理及准备取样品10g或10ml，用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解并稀释至100ml，为10%的试样。当样品含有抑菌物质时，应按相应物料“抽样检验规程”所规定的方法和要求予以处理，如稀释法、离心法、中和法、薄膜过滤法等。5.2增菌培养及分离培养。5.2.1增菌培养：取10%的试样10ml（相当于样品1g或1ml），接种于胰酪大豆胨液体培养基（不少于100ml）中，混匀，置30～35℃培养18～24小时。5.2.2选择分离培养：取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时后，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时5.2.3结果判断：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌5.3对照实验5.3.1阳性对照试验：用阳性菌代替供试品按照5.2项操作，对照菌的加入量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出大肠埃希菌5.3.2阴性对照试验：以稀释剂代替供试液，按照5.2项操作，阴性对照应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。42~44℃麦康凯琼脂平板麦康凯液体培养基供试品供试液增菌培养42~44℃24~48hr18~72hr可疑无菌落生长报告结果有菌落生长菌落形态特征报告结果报告结果革兰氏染色、镜检生化试验(IMViC)疑似菌落纯培养30~35℃18~24hr.’.5.4鉴定试验5.4.1菌落形态鉴定：麦康凯琼脂培养基上大肠埃希菌菌落形态特征：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形、扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。若麦康凯琼脂培养基上出现可疑菌落时挑取菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC实验，确认是否为大肠埃希菌。5.4.2纯培养如果麦康凯琼脂培养基平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，蘸取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，温度30～35℃培养18～24hr，进行以下检查。如果平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（如呈紫黑色或有金属光泽），则应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于麦康凯琼脂培养基平板，温度30～35℃培养18～24hr，再挑选单个疑似菌落，纯培养，进行以下检查。5.4.3革兰氏染色、镜检5.4.3.1以接种环蘸取无菌水于洁净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次固定。5.4.3.2在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。5.4.3.3滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。5.4.3.4滴加95%乙醇，严格控制时间脱色20～30s，水洗。5.4.3.5滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。5.4.3.6镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌。5.4.4生化（IMViC）试验5.4.4.1乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，温度30～35℃培养24～48hr，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为了避免迟缓发酵产生假阴性，也可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24hr出现阳性，或适当延长培养时间。5.4.4.2靛基质试验（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，温度30～35℃培养24～48hr，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性（+），呈试剂本色为阴性（-）。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24Hr即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24hr，做靛基质试验。5.4.4.3甲基红试验（M）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度30～35℃培养48±2hr，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约每1ml培养液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性（-）。5.4.4.4乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度30～35℃培养48±2hr，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4hr（通常在30min时）内出现红色判为阳性（+），无红色判为阴性（-）。.’.5.4.4.5枸橼酸盐利用试验（C）取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，温度30～35℃培养2～4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时，判为阳性（+），培养基颜色无变化、无菌苔生长，判为阴性（-）。5.4.4结果判断：当IMViC试验为“-+--”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；IMViC试验为“++--”、革兰氏阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。其他情况报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。见下表：大肠埃希菌IMViC实验结果判断实验结果结果判断靛基质(I)甲基红(M)V-P(Vi)枸橼酸盐利用实验(C)++--典型大肠埃希菌-+--非典型大肠埃希菌++-+典型中间型-+-+非典型中间型--++典型产气菌+-++非典型产气菌6.报告6.1填写记录由操作人员及时收集和填写检查记录，见《大肠埃希菌检查记录》。6.2问题及偏差处理操作过程中发现结果超标或异常时，应进行分析和调查，可按照“OOS处理规程(SMP-QC-002)”进行，当OOS处理发现OOS不成立，可参考“偏差处理规程（SMP-QA-007）”进行，偏差及其处理同样应当予以记录。6.3记录审核与上交记录填写后应及时上交QC收发人员，按批记录的要求进行整理和审核，最后由部门负责人签字后上交质量保证部。7.注意事项7.1贵重物料或物料量本身较少时，检验量可根据实际需要予以采集和取用。7.2样品处理时的温度及培养基的温度均不得超过45℃。7.3供试液配后应在1小时内接种。7.4应在无菌操作台上以无菌操作的要求进行。7.5阳性试验应在阳性间生物安全柜中进行。8.附件无。9.派生记录R-SOP-QC4-010-01大肠埃希菌检查记录10.相关文件1、SMP-QC-002OOS处理规程2、SMP-QA-007偏差处理规程.’.11.变更记录版本号.生效日期变更原因、依据及详细变更内容002015.12.01依据2015版药典修改操作规程