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LightShift化学发光法EMSA试剂盒试剂盒组成化学发光法EMSA优化和质控试剂盒（20148×）10×BindingBuffer，1ml，保存于-20°CBiotin-EBNAControlDNA，50μl，保存于-20°CUnlabeledEBNADNA，50μl，保存于-20°CEpstein-BarrNuclearAntigen(EBNA)Extract，125μl，保存于-20°CPoly(dI.dC)，125μl，保存于-20°C50%Glycerol，500μl，保存于-20°C1%NP-40，500μl，保存于-20°C1MKCl，1ml，保存于-20°C100mMMgcl2，500μl，保存于-20°C200mMEDTA，500μl，保存于-20°C5×LoadingBuffer，1ml，保存于-20°C化学发光核酸检测模块（89880）StabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate，1.5ml，保存于4°CChemiluminescentSubstrate，4°C可保存1年Luminol/EnhancerSolution，80mlStablePeroxideSolution，80mlBlockingBuffer，500ml，保存于4°C4×WashBuffer，500ml，保存于4°CSubstrateEquilibrationBuffer，500ml，保存于4°CEMSA步骤A配胶和预电泳1用0.5×TBE配制非变性聚丙烯酰胺凝胶，大多数采用0.5×TBE配制4-6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶2用0.5×TBE灌注电泳槽，直至刚好没过加样孔底部。3冲洗加样孔，100V预电泳30-60minB进行结合反应1融化所有结合反应成分，EBNA相关成分和待检测样品放在冰上，避免DNA探针过热。EBNA提取物加入前再融化。2结合反应，根据Table1，2，3准备20μl结合反应体系Table1反应反应成分说明#1Biotin-EBNAControlDNA没有蛋白和DNA结合所以观察不到迁移。显示出无迁移探针带位置#2Biotin-EBNAControlDNA＋EBNAExtract有足够的蛋白和Biotin-EBNAControlDNA结合出现迁移显示出迁移探针带位置#3Biotin-EBNAControlDNA＋#2反应出现的迁移探针带被200倍过量的UnlabeledEBNAEBNAExtract＋200倍过量的UnlabeledEBNADNADNA竞争性抑制Table2质控反应（μl）成分终浓度#1#2#3纯水10×BindingBuffer50%Glycerol100mMMgcl2Poly(dI.dC)1%NP-40UnlabeledEBNADNAEBNAExtractBiotin-EBNAControlDNA总体积---------1×2.5%5mM50ng/μl0.05%4pmol1Unit20fmol------1221111----------2201121111-----122092111121220Table3检测反应（μl）成分终浓度#1#2#3纯水10×BindingBufferPoly(dI.dC)50%Glycerol（可调）1%NP-40（可调）1MKcl（可调）100mMMgcl2（可调）200mMEDTA（可调）未标记的目的DNA蛋白提取液生物素末端标记的目的DNA总体积-----1×50ng/μl4pmol20fmol------21-----------2021------2021203室温孵育20min4加入5μl5×LodingBuffer，轻柔上下吹匀，不可剧烈混匀。C电泳1关闭电源2冲洗加样孔，每孔加样20μl3打开电源，100V电泳，溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳D转膜1将尼龙膜浸于0.5×TBE，至少10min。2用冷却至10°C的0.5×TBE和干净的海绵，镊子，手套进行转膜3100V，380mA转膜30-60min，4转膜结束后，将膜（带有溴酚蓝的一面）放在干纸巾上1min，使膜表面的缓冲液吸进膜内。不能使膜变干。立即进行步骤EE交联用手持UV灯离膜0.5cm处254nm照膜5-10min，将DNA与膜交联。F化学发光法检测生物素标记的DNA137-50°C缓慢加温BlockingBuffer和4×WashBuffer，直至颗粒完全溶解。SubstrateEquilibrationBuffer在4°C和室温条件下使用。2用20mlBlockingBuffer封闭膜，轻柔摇床孵育15min3将66.7μlStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidaseConjugate加至20mlBlockingBuffer中，配制Conjugate/BlockingBuffer。4轻轻倒掉BlockingBuffer，换成Conjugate/BlockingBuffer，轻柔摇床孵育15min5将40ml4×WashBuffer加至120ml纯水中，配制1×WashBuffer6将膜移入新容器内，用20ml1×WashBuffer短暂洗一次7用20ml1×WashBuffer轻柔摇床多次洗膜，每次5min8将膜移入新容器内，加入30mlSubstrateEquilibrationBuffer，轻柔摇床孵育5min9将6mlLuminol/EnhancerSolution加至6mlStablePeroxideSolution中，配制SubstrateWorkingBuffer，需避光。10将膜从SubstrateEquilibrationBuffer提起，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer。将膜移入新容器内。11用SubstrateWorkingBuffer覆盖膜的全部表面，不要摇动，孵育5min12将膜从SubstrateWorkingBuffer提起，用纸巾轻轻接触膜的边缘，吸掉残余的Buffer，但不要使膜变干。13用塑料包包住湿膜，避免气泡和起皱。14显影并拍照